Inmunoensayo cualitativo para la determinación de residuos de antibióticos de tetraciclina en muestras de leche seguido de una HPLC cuantitativa mejorada

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 14502 (2022) Citar este artículo

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El contaminante ambiental es uno de varios problemas que dañan a las personas y la vida silvestre. Un ejemplo de contaminantes emergentes actuales son los residuos de antibióticos que pueden presentarse en el agua y los alimentos. Aunque los antibióticos están destinados a tratar o prevenir infecciones humanas y animales, también se han utilizado como complementos alimenticios para animales por su capacidad para promover el crecimiento y la eficiencia alimenticia. Este uso excesivo de antibacterianos ha resultado en la acumulación de residuos de antibióticos en productos alimenticios que eventualmente son consumidos por los humanos. La exposición continua e innecesaria de los seres humanos a los antibióticos a través de la carne o la leche de los animales, o indirectamente a través de las plantas o el suelo, puede aumentar la posibilidad de que surjan bacterias multirresistentes y, en consecuencia, afectar negativamente a la salud humana. Se han impuesto nuevas regulaciones con respecto a la utilización de antibióticos. Debido a la escasez de datos sobre las condiciones de los residuos de antibióticos en diferentes tipos de alimentos destinados al consumo humano en Arabia Saudita, este estudio propuso un método cromatográfico optimizado (HPLC-DAD) seguido de un enfoque de inmunoensayo para detectar específicamente antibióticos tetraciclinas en muestras de leche animal. El método se llevó a cabo utilizando una columna RP-C18 con una fase móvil consistente en KH2PO4 0,01 M:acetonitrilo:metanol (70:20:10, v/v/v) ajustada a pH 4. Se observaron mejoras en el método en términos de resolución y sensibilidad. El método de precipitación de proteínas utilizado para la extracción demostró un alto porcentaje de recuperación, del 85 al 101 %. El método fue validado según las directrices de la Conferencia Internacional para la Armonización (ICH). De estas conclusiones se desprende claramente que la presencia de residuos de antibióticos de tetraciclina y oxitetraciclina en los productos lácteos procedentes del mercado saudita está por debajo de los límites residuales máximos (LMR).

La contaminación ambiental es un desafío al que se enfrenta el mundo en el siglo actual. Esta cuestión se define como “la contaminación de los componentes físicos y biológicos del sistema tierra/atmósfera hasta tal punto que los procesos ambientales normales se vean afectados negativamente”1. Las sustancias o energía que se presentan por encima de los niveles naturales se consideran contaminantes1. Los residuos de antibióticos son una forma de contaminante ambiental que puede presentarse en animales, plantas o suelo y puede promover el desarrollo de resistencia microbiana. La resistencia microbiana que se produce por el uso y la exposición innecesarios a antibióticos se define como cambios en los mecanismos de resistencia bacteriana o el desarrollo de nuevos mecanismos en respuesta a antibióticos específicos, una clase de antibióticos o varios tipos de antibióticos a los llamados patógenos multirresistentes. MDR)2. En un intento por preservar la actividad antimicrobiana, las autoridades reguladoras han restringido el proceso de prescripción de antibióticos. Sin embargo, los antibióticos también se utilizan como conservantes de alimentos, para promover el crecimiento y mejorar la productividad del ganado vacuno y avícola, además de su uso en medicina veterinaria3,4,5. Investigaciones anteriores han demostrado que el uso de altos niveles de antibióticos para aumentar la productividad animal está asociado con la presencia de residuos de antibióticos en alimentos de origen animal6,7,8. La exposición continua del ser humano a residuos de antibióticos puede ser perjudicial para el ser humano, aumentando la posibilidad de desarrollar reacciones alérgicas, alterando la flora intestinal normal o puede transferir bacterias resistentes a los antibióticos (BRA) o genes de resistencia a los antibióticos (ARG) de los animales a los humanos5.

La tetraciclina (TTR), la clortetraciclina (CTC) y la oxitetraciclina (OXY), se encuentran entre los antibióticos más utilizados en la ganadería debido a su efectividad y bajo costo9,10. Numerosos estudios han demostrado la utilización inadecuada de estos antibióticos en todo el mundo y las consecuencias de dicha práctica6,11. Por ejemplo, existe un uso incontrolado de antibióticos en los piensos mixtos de los animales o como conservantes en la industria alimentaria12,13. Además, a menudo se administran antibióticos a los animales directamente antes del sacrificio o se introducen en la arteria carótida inmediatamente después del sacrificio para aumentar el período de almacenamiento de la carne fresca12. Con el tiempo, las concentraciones residuales de antibióticos pueden exceder los límites residuales máximos (LMR) permitidos por la Unión Europea (UE) y la Organización Mundial de la Salud (OMS).

Los métodos de determinación de antibióticos tetraciclina (CT) han sido investigados exhaustivamente mediante muchos métodos analíticos en diferentes muestras de productos alimenticios, así como en muestras ambientales. Por ejemplo, Al-Ghamdi et al. confirmaron el uso indebido de antibióticos CT en productos avícolas en la región oriental de Arabia Saudita utilizando un método microbiológico14. Además, otros dos estudios realizados en la región de Al-Ahsa'a han demostrado la presencia de residuos de antibióticos en animales. El primer estudio utilizó LC-MS/MS para detectar residuos de nueve antibióticos (quinolonas, fluoroquinolonas, sulfonamidas y tetraciclinas) en tejidos de camellos, bovinos y ovinos15. El segundo, de Al-Nazawi et al., utilizó la prueba Delvotest P Multiplate para detectar principalmente CT, estreptomicina y neomicina en productos lácteos16.

Gran parte de la literatura actual utiliza cromatografía líquida junto con espectrometría de masas LC-MS/MS como el método más apropiado para la detección y cuantificación de antibióticos multiclase en muestras de alimentos y leche17,18. Se han informado otras técnicas para la determinación de residuos de antibióticos CT en muestras de leche, incluida la electroforesis capilar (CE-FL19 y CE-DAD20), una detección microbiológica21 y un método espectroscópico22. Los datos de dos artículos de revisión recientes revelaron el uso de kits inmunológicos como herramienta de monitoreo de residuos de antibióticos tetraciclinas en la leche12,17. La Tabla 1 resume algunos métodos cromatográficos informados para la determinación de residuos de antibióticos CT en muestras de leche mediante HPLC-DAD. Estos artículos de revisión señalan una serie de similitudes entre los métodos publicados. La gran mayoría de los estudios han utilizado una fase estacionaria C18 con HPLC12 de fase inversa. Además, se ha observado que las mezclas binarias de agua-acetonitrilo o agua-metanol con diferentes concentraciones de componentes orgánicos se utilizan con mayor frecuencia que las mezclas terciarias (agua-acetonitrilo-metanol). Los ácidos oxálico, fórmico, acético y cítrico se encuentran entre los productos químicos más utilizados en la fase móvil12,23. Se han descrito sistemas de elución en gradiente con muestras complejas y mezclas de antibióticos, que permiten realizar la separación12.

El principal objetivo del estudio fue determinar los residuos de antibióticos tetraciclinas en muestras de leche del mercado saudí mediante HPLC acoplado a la técnica DAD.

Los materiales de referencia de oxitetraciclina (98,07 % de pureza NMR), tetraciclina (> 98,00 %), clortetraciclina (> 95,00 %) y el estándar interno ornidazol (ORZ, > 99,00 %) se adquirieron de Haoyuan ChemExpress Co., Ltd. (Shanghai, China). ). El dihidrógeno ortofosfato de potasio anhidro (KH2PO4) se obtuvo de Loba Chemie Pvt. Limitado. Ltd. (Bombay, India). La sal disódica dihidratada del ácido etilendiaminotetraacético (Na2EDTA) se obtuvo de Sigma-Aldrich Chemie Gmbh (Steinheim, Alemania). El ácido ortofosfórico (H3PO4) se obtuvo de Avonchem Ltd. (Cheshire, Reino Unido). Los disolventes acetonitrilo y metanol en la fase móvil eran de calidad UHPLC y HPLC. En todos los experimentos se utilizó agua desionizada. Se compraron muestras de leche en múltiples mercados y granjas locales de la ciudad de Riad. Los kits de prueba de inmunoensayo rápido de tetraciclina se obtuvieron de Meizheng Biotech Group, una empresa de PerkinElmer (Beijing, China). El sistema HPLC (Waters, Milford, MA, EE. UU.) constaba de una bomba HPLC binaria Waters 1525, un detector de matriz de fotodiodos Waters 2998 y un muestreador automático Waters 2707. Los datos fueron adquiridos y procesados utilizando el software Waters Empower 3.

Las separaciones cromatográficas se llevaron a cabo en una columna Macherey-Nagel C18 de fase inversa (250 × 4,5 mm de diámetro interior, tamaño de partícula de 5 μm). La fase móvil era una mezcla de dihidrógeno ortofosfato de potasio 10 mM: acetonitrilo: metanol en una proporción de 70:20:10 (v/v/v), y el pH se ajustó a 4 con ácido ortofosfórico 0,01 M. La fase móvil se filtró a través de un papel de filtro Whatman de 0,45 µm seguido de desgasificación durante 10 minutos y luego se entregó a un caudal de 1 ml/min. El análisis se realizó a 25 °C y la elución de los compuestos se controló con un detector de matriz de diodos (DAD) de 210 a 600 nm. Los cromatogramas se registraron a 358 nm y el volumen de inyección fue de 50 µl.

Se prepararon en metanol soluciones madre (1) a concentraciones de 1 mg/ml para OXY, TTR, CTC y estándar interno ORZ. Se requirió una dilución adicional para preparar la solución madre mixta (2) a una concentración de 10 µg/ml para cada solución, y las concentraciones de trabajo utilizadas fueron 0,09, 0,3, 0,5, 0,7 y 1 µg/ml. La solución madre de estándar interno (2) se preparó por separado mediante el mismo procedimiento. Las soluciones se mantuvieron en un congelador (-20 ℃) y se sellaron de la luz durante un período de un mes24,25.

Las muestras de leche (n = 100) se clasificaron principalmente según su especie en leche de vaca, camello y cabra. Otras clasificaciones incluyeron su fuente (producto comercial local/producto comercial importado/granjas locales), vida útil (fresca/larga vida), contenido de grasa (leche entera, baja en grasa y desnatada) y alimentación (orgánica/no orgánica). La información de las muestras se muestra en la Tabla 2. La leche se compró en granjas y mercados saudíes locales (ciudad de Riad) durante los meses de octubre a noviembre de 2021 y febrero de 2022.

La extracción de muestras de leche implica la adición de un disolvente orgánico para precipitar la proteína y un agente quelante. Esta técnica es común y ha sido utilizada en muchos estudios23. Las muestras se prepararon mediante el siguiente procedimiento. El proceso de extracción se inició mezclando 2 mL de una muestra de leche con 0,4 mL de Na2EDTA 0,2 M y 0,6 mL de metanol en tubos de centrífuga de polipropileno. Una vez que se formó una solución homogénea, el tubo se centrifugó a 16.000 rpm durante 20 minutos, se filtró a través de un filtro de jeringa Whatman de 0,22 µm en un vial de HPLC para su análisis.

El kit de prueba rápida de tetraciclina es un ensayo cualitativo que determina la presencia de residuos de antibióticos de tetraciclina en la leche de vaca y de camello. Los componentes del kit deben alcanzar la temperatura ambiente (20–25 ℃) antes de su uso. Las muestras de leche se agitaron y se agregaron a los micropocillos (200 µL de muestras de leche de vaca y 100 µL de muestras de leche de camello diluidas con 100 µL de agua desionizada). El polvo de conjugado de recubrimiento se disolvió pipeteando el contenido hacia arriba y hacia abajo 5 veces. Las mezclas de muestras se incubaron durante 2 minutos a temperatura ambiente antes de colocar la tira reactiva en los micropocillos. Se observó el desarrollo del color de las tiras reactivas durante 5 minutos y luego se retiraron, y los resultados se interpretaron en 1 minuto.

Después de revisar la literatura, se ha observado que muchos métodos analíticos de CT se llevan a cabo utilizando ácido oxálico como solución de ácido orgánico en la fase móvil, además de acetonitrilo y metanol como modificadores orgánicos. Los experimentos preliminares en estas condiciones revelaron los efectos de cada componente de la fase móvil. Por ejemplo, aumentar la proporción de acetonitrilo por encima del 20 % redujo significativamente la resolución. Para optimizar el método en materiales de referencia, se estudiaron diferentes concentraciones de ácido oxálico con diferentes proporciones del modificador orgánico. La relación preliminar de la fase móvil fue 70:20:10 (v/v/v) solución de ácido oxálico 10 mM, acetonitrilo y metanol, respectivamente. De acuerdo con publicaciones anteriores, nuestros resultados indicaron que el ácido oxálico 25 mM mostró una resolución óptima sobre otras concentraciones probadas (0, 10, 40, 50 y 60 mM). Nuestros hallazgos también mostraron que se observaron tiempos de retención más cortos con ácido oxálico 10 mM.

Con respecto a los modificadores orgánicos, se demostró una separación de picos con resolución satisfactoria con acetonitrilo solo como modificador orgánico en una proporción del 20%. Sin embargo, el uso de acetonitrilo solo aumenta el tiempo de retención hasta 30 minutos. lo que reveló que tanto el metanol como el acetonitrilo son necesarios para condiciones óptimas. El aumento de las proporciones por encima del 20% y el 10% para acetonitrilo y metanol, respectivamente, dio como resultado una reducción significativa en la resolución, mientras que la disminución de estas proporciones resultó en un tiempo de ejecución más prolongado. Estos hallazgos respaldan ampliamente el trabajo de otros estudios en el caso del análisis del material de referencia estándar, ya que este método no ha logrado proporcionar una resolución aceptable cuando se aplica a matrices lácteas. Sorprendentemente, se demostró una interferencia máxima entre un componente de la matriz láctea y los picos de CT. Por lo tanto, no se obtuvo una resolución aceptable, lo que sugiere una mayor optimización del método en una matriz de leche enriquecida. Las Figuras 1 y 2 muestran una descripción general de los cromatogramas experimentales de los efectos del cambio de la concentración de ácido oxálico en la matriz de leche enriquecida con fármaco. Contrariamente a lo esperado, estos juicios no lograron una resolución razonable; Los métodos no lograron separar el pico de la matriz de los picos del fármaco, a pesar de las diferentes proporciones y concentraciones utilizadas. En general, estos hallazgos indican que la fase móvil a base de ácido oxálico no es adecuada para matrices lácteas.

Los efectos del cambio de la concentración de ácido oxálico sobre los fármacos aumentaron la leche de vaca. (a) Ácido oxálico 5 mM:ACN:MeOH (70:20:10). (b) Ácido oxálico 10 mM:ACN:MeOH (70:20:10). (c) Ácido oxálico 15 mM:ACN:MeOH (70:20:10). Condiciones cromatográficas: Volumen de inyección: 30 µL, Temperatura: 25 ℃, Caudal: 1 ml/min, Longitud de onda de detección: 358 nm.

Los efectos del cambio de la concentración de ácido oxálico sobre los fármacos aumentaron la leche de vaca. (a) Ácido oxálico 25 mM:ACN:MeOH (70:20:10). (b) Ácido oxálico 30 mM:ACN:MeOH (70:20:10). (c) Ácido oxálico 50 mM:ACN:MeOH (70:20:10). Condiciones cromatográficas: Volumen de inyección: 30 µL, Temperatura: 25 ℃, Caudal: 1 ml/min, Longitud de onda de detección: 358 nm.

Trabajos anteriores plantearon la posibilidad de sustituir el ácido oxálico por dihidrógenofosfato de potasio KH2PO4 como sal inorgánica en la fase móvil junto con los modificadores orgánicos para la determinación de antibióticos TC. Por ejemplo, la determinación de OXY y TTR en muestras de leche se llevó a cabo utilizando un sistema de elución isocrático de dihidrógenofosfato de potasio 0,05 M (pH 2,8)/ACN (80:20, v/v)26. El resultado del experimento práctico preliminar fue prometedor y alentó a realizar más investigaciones que evalúen diferentes concentraciones de KH2PO4 con diferentes proporciones de modificador orgánico.

Inicialmente se ensayó KH2PO4 0,025 M con ACN y MeOH en diferentes proporciones. Sin embargo, al disminuir KH2PO4 a 0,01 M se obtuvo una mejor resolución. La Figura 3 representa el efecto de cambiar las proporciones de las composiciones móviles en la matriz de leche enriquecida. Quizás el hallazgo más significativo es que se logra una buena separación con la fase móvil en una proporción de 70:20:10 de KH2PO4:ACN:MeOH. Sin embargo, se observó una reducción en la sensibilidad, que se esperaba que se debiera a la pérdida del farmacóforo en la estructura química de los TC y al cambio del pH de la fase móvil. Por lo tanto, se evaluó el pH de la fase móvil para aumentar la sensibilidad.

Efecto de la concentración de KH2PO4 en la leche de vaca enriquecida. (a) KH2PO4 25 mM: ACN: MeOH (70:20:10). (b) KH2PO4 10 mM: ACN: MeOH (70:20:10).

La influencia del pH se evaluó utilizando ácido ortofosfórico 0,1 M para ajustar la mezcla de fase móvil de KH2PO4:ACN:MeOH 0,01 M en una proporción de 70:20:10 en el rango de pH de 2 a 5,5. El cambio del pH se evaluó en términos del efecto sobre la resolución y la sensibilidad. Se observó un aumento en la resolución hacia el pH de 5,5, mientras que en esta región se perdió la sensibilidad. Disminuir el pH a cerca de 2-3 mejoró la sensibilidad, pero la resolución disminuyó. A pH 4, la fase móvil mostró una resolución satisfactoria y una sensibilidad aceptable para el propósito del estudio, por lo que fue elegida para la evaluación de muestras de leche. La Figura 4 muestra un cromatograma para el método propuesto.

El cromatograma del método propuesto. Condiciones cromatográficas: KH2PO4 10 mM: ACN: MeOH (70:20:10), Volumen de inyección: 50 µL, Temperatura: 25 ℃, Caudal: 1 ml/min, Longitud de onda de detección: 358 nm.

Aunque solo se detectaron trazas de clortetraciclina (CTC), ajustar el pH de la fase móvil a 4 proporcionó buena resolución y sensibilidad. Alternativamente, aumentar el volumen de inyección para aumentar la detección y reducir los límites de cuantificación de CTC. Una regla general es mantener el volumen de inyección lo más bajo posible para evitar la sobrecarga de la columna y el ensanchamiento del pico27. Se examinó un aumento gradual en el volumen de inyección para garantizar que se detectaran concentraciones bajas de CTC sin signos de ampliación del pico. El volumen de inyección se ajustó a 50 µL, ya que está dentro de la capacidad del instrumento, y no se observaron signos de ensanchamiento del pico (Fig. 4).

Los espectros de absorción de los tres fármacos, OXY, TTR y CTC, se investigaron con un DAD en el rango de longitud de onda de 200 a 600 nm. Los espectros de los tres fármacos revelaron dos valores lambda máximos, 267 nm y 358 nm. Se seleccionó la longitud de onda de 358 nm como la longitud de onda de detección óptima ya que la matriz de la muestra es compleja y aparecieron muchos picos de interferencia a 267 nm. La Figura 5 muestra los espectros de absorbancia de los analitos objetivo.

Espectros de absorbancia de los analitos objetivo (a) oxitetraciclina, (b) tetraciclina, (c) clortetraciclina y (d) estándar interno.

El procedimiento de extracción fue desarrollado para obtener un buen porcentaje de recuperación manteniendo una muestra concentrada. Los métodos informados anteriormente indicaron que las matrices alimentarias tienen un alto contenido de proteínas, por lo tanto, se emplea la precipitación de proteínas en el paso de pretratamiento17. Además, las moléculas de CT tienen una alta afinidad para formar quelatos de complejos metálicos con cationes metálicos polivalentes como calcio y magnesio (Ca+2 y Mg+2); sin embargo, esta formación de complejos podría prevenirse agregando un agente quelante a la muestra12. El ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y disolventes orgánicos como el acetonitrilo y el metanol se han utilizado ampliamente en el pretratamiento de muestras de leche23. En el procedimiento de extracción propuesto, se identificaron tres factores clave que podrían afectar el porcentaje de recuperación y la concentricidad de la muestra: (1) el volumen del solvente orgánico, (2) la concentración del agente quelante y (3) la Tiempo y velocidad de centrifugación. El volumen de metanol se mantuvo al mínimo para evitar la dilución de la muestra. En este método se empleó EDTA sódico (Na2-EDTA), que es más fácilmente soluble en agua que el EDTA, como agente quelante sin ajuste adicional del pH. Se demostró que aumentar el tiempo y la velocidad de centrifugación y la concentración de Na2-EDTA a 0,2 M daba como resultado un aumento significativo en la transparencia del sobrenadante y el porcentaje de recuperación.

La validación del método se realizó mediante análisis estadístico según las directrices del Consejo Internacional de Armonización ICH28. Los parámetros de validación se evaluaron en el material de referencia del fármaco y en las tres matrices lácteas diferentes (vaca, camello y cabra). Se investigaron la selectividad y el porcentaje de recuperación en matrices lácteas, además de la linealidad, los límites de detección y cuantificación, la precisión y la exactitud.

La respuesta de linealidad de cada fármaco se determinó trazando la relación del área del pico del fármaco sobre el área del pico del IS frente a la concentración del fármaco, y luego se establecieron las ecuaciones de regresión. La curva de calibración fue lineal en el rango de 0,09 a 1 µg/ml (90 a 1000 ng/ml) para cada fármaco. Los coeficientes de correlación fueron > 0,9998 para cada fármaco, lo que demuestra que el método es lineal en el rango especificado. Las concentraciones utilizadas para la curva de calibración fueron 0,09, 0,3, 0,5, 0,7 y 1 µg/ml.

Los límites de detección y cuantificación se determinaron según la relación señal-ruido. El límite de detección se estableció como una relación señal-ruido de 3:1, mientras que el límite de cuantificación se estableció como una relación señal-ruido de 10:1. Los límites de detección de OXY y TTR fueron 20 ng/mL (0,020 µg/mL), mientras que el límite de detección de CTC fue de 80 ng/mL (0,080 µg/mL). El límite de cuantificación fue de 50 ng/mL (0,050 µg/mL) para OXY y TTR y de 90 ng/mL (0,090 µg/mL) para CTC.

La precisión se evaluó preparando diferentes concentraciones de mezclas de fármacos dentro del rango lineal y una concentración fija de ornidazol como IS (0,8 µg/ml) y luego calculando el % de recuperación y el error relativo. La Tabla 3 muestra un buen porcentaje de recuperación (conc. teórica/conc. práctica%) y un pequeño error relativo para OXY, TTR y CTC. Para la precisión intradiaria, las mismas concentraciones de fármaco utilizadas para evaluar la precisión se analizaron tres veces el mismo día y luego en los dos días siguientes para evaluar la precisión interdía. Los valores de desviación estándar relativa (RSD) se calcularon para cada fármaco y concentración en la Tabla 3. Los valores de RSD bajos (< 2) indican un alto grado de precisión.

La selectividad del método se evaluó examinando el cromatógrafo de la muestra de leche en blanco (libre de analitos analizados mediante inmunoensayo y HPLC antes de la adición) frente a una muestra de leche y agua enriquecida. Las tres matrices de leche no mostraron picos de interferencia en los tiempos de retención de los analitos; por lo tanto, se demostró que el método es específico para los CT en la matriz láctea. La Figura 6 muestra un ejemplo de la selectividad del método en la leche de vaca (la muestra de leche en blanco versus la muestra de leche y agua enriquecida).

Selectividad de la matriz de la leche de vaca. Fase móvil: KH2PO4:ACN:MeOH (70:20:10), pH 4.

Los porcentajes de recuperación se calcularon como la relación entre la respuesta de la leche enriquecida y las muestras de agua enriquecidas en la misma concentración. Los porcentajes de recuperación de OXY, TTR y CTC en la matriz láctea estuvieron dentro del rango especificado (80-120%). Los porcentajes medios de recuperación ± DE de OXY, TTR y CTC en leche de vaca fueron 94,45% ± 4,00, 88,77% ± 3,89 y 89,86% ± 2,41, respectivamente. Para la leche de camello y de cabra, fueron 101,20% ± 4,05, 98,43% ± 2,28 y 89,33% ± 11,03 y (96,45% ± 2,10, 92,73% ± 3,95 y 86,70% ± 1,95 para OXY, TTR y CTC, respectivamente.

La respuesta de linealidad de cada fármaco en las tres matrices de leche se determinó trazando la relación del área del pico del fármaco sobre el área del pico de IS frente a la concentración del fármaco enriquecida en la muestra de leche en blanco, y luego se establecieron las ecuaciones de regresión y se presentaron en la Tabla 4. Las curvas de calibración fueron lineales en el rango de 0,09 a 1 µg/ml para OXY y TTR, mientras que el rango de CTC fue de 0,200 a 1 µg/ml (200 a 1000 ng/ml). Los coeficientes de correlación fueron ≥ 0,9997 para cada fármaco, lo que demuestra que el método es lineal en un rango específico. Las concentraciones utilizadas para la curva de calibración fueron 0,09, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 y 1 µg/ml.

Los límites de detección y cuantificación se determinaron según la relación señal-ruido. El límite de detección se estableció como una relación señal-ruido de 3:1, mientras que el límite de cuantificación se estableció como una relación señal-ruido de 10:1. La Tabla 4 muestra las ecuaciones de regresión y los valores de r para cada fármaco en matrices de leche, además del límite de detección (LOD) y el límite de cuantificación (LOQ). Aunque el LMR de CTC en la leche fue de 0,100 µg/mL, aquí la concentración de CTC detectada con mayor frecuencia en la matriz láctea fue de 0,180 µg/mL, y la capacidad de cuantificación comenzó en solo 0,200 µg/mL, lo que se considera un inconveniente de el método.

La precisión y la exactitud se investigaron en muestras de leche enriquecidas y se analizaron tres veces en el mismo día y en tres días sucesivos. La Tabla 5 revela que el método propuesto tiene un alto grado de exactitud y precisión.

El enfoque metodológico adoptado en este estudio es una combinación de análisis cualitativo y cuantitativo. Al emplear un enfoque cualitativo, fue más fácil realizar este estudio exploratorio con el fin de escanear el tamaño de muestra más alto posible. La técnica de inmunoensayo es útil para identificar muestras positivas en poco tiempo. El kit de prueba rápida de CT utilizado es un ensayo de flujo lateral que puede determinar cualitativamente los residuos de CT en leche de vaca y camello (100 µg/kg). Una tira reactiva se compone de una almohadilla absorbente en el extremo inferior y dos líneas en una membrana de nitrocelulosa (línea T y línea C). La línea T es la línea de prueba, que une las moléculas de TC, mientras que la línea C es la línea de control, que une los anticuerpos secundarios para indicar la validez de la tira reactiva. El componente principal de la prueba son los anticuerpos de tetraciclina conjugados con oro que deben mezclarse con la muestra antes de insertar la tira reactiva. El kit no es selectivo para cada antibiótico de TC y sus valores de sensibilidad (límites de detección) se establecieron en 14 µg/kg para TTR y CTC y 10 µg/kg para OXY y doxiciclina.

La Figura 7 muestra la presentación visual de los resultados de la prueba para muestras positivas y negativas y los resultados no válidos. La interpretación del resultado se basa en visualizar y comparar las intensidades de color para determinar si los residuos de TCs en la muestra son mayores al LMR (100 µg/kg) o dentro de la limitación, por lo que existe una fuente de sesgo o incertidumbre debido a la naturaleza autoinformada del resultado como un estudio observacional. Por lo tanto, para minimizar la interpretación falsa negativa del resultado, este kit se utilizó para detectar si había residuos de antibióticos TC en una muestra, independientemente del nivel, de modo que la muestra que muestra un grado cercano o igual de similitud de color entre la línea T y la línea C se considera una muestra positiva y, por lo tanto, se clasifica con las muestras positivas (solo la línea C visible o la línea T débil) para su posterior determinación mediante análisis HPLC-DAD.

Muestra negativa (-): la muestra está libre de residuos de tetraciclinas si la intensidad de la línea T es mayor que la línea C, y es inferior a la limitación si sus intensidades son similares. Muestra positiva (+): Los residuos de antibióticos de los TC son iguales a la limitación si la intensidad de la línea T es más ligera que la línea C, y es mayor que la limitación si solo es visible la línea C. Resultado no válido: si la línea C es invisible.

Para el control de calidad, se prepararon un control positivo (tetraciclina: 14 ppm = 14 ng/mL) y una muestra de control negativo de acuerdo con las instrucciones y se analizaron cada vez que se usó el kit, además de una muestra de leche enriquecida con 100 ng/mL. TC. Este procedimiento asegura la sensibilidad y validez del kit durante el tiempo de almacenamiento. Además, una muestra aleatoria de cada una de las cinco muestras negativas se sometió a análisis mediante HPLC-DAD para confirmar el resultado del inmunoensayo.

Primero se escanearon muestras de leche de vaca y de camello en busca de residuos de antibióticos TC mediante el kit de inmunoensayo. Solo las muestras que mostraron una línea T oscura en comparación con la línea C con residuos de antibióticos CT según el kit de inmunoensayo se consideraron muestras negativas y se excluyeron del análisis HPLC-DAD. Las muestras que mostraban solo una línea C o una línea T que era débil o similar en intensidad a la línea C se determinaron para residuos de antibióticos de TC mediante HPLC-DAD, junto con las muestras de leche de cabra. El día del análisis, se prepararon e inyectaron muestras de agua y leche enriquecidas para garantizar la idoneidad del sistema cromatográfico. Luego se prepararon muestras de leche y se inyectaron en el sistema HPLC-DAD. Los tiempos de retención de estos picos se compararon con los tiempos de retención de la muestra de leche enriquecida y con los espectros UV. El siguiente paso fue enriquecer estas muestras con una concentración conocida de fármacos y luego inyectarlas dos veces y examinar su pureza máxima para excluir cualquier interferencia de la matriz. El nivel de residuos de antibióticos CT se determinó calculando su concentración frente a leche enriquecida con una concentración conocida de los medicamentos. El flujo de trabajo se representa en la Fig. 8.

Diagrama esquemático del flujo de trabajo.

Para la prueba cualitativa en leche de vaca y de camello (hubo 18 muestras positivas en dos tipos de leche; 17 muestras fueron leche de vaca y 1 muestra fue leche de camello). Estas muestras positivas se analizaron más a fondo mediante el método propuesto para determinar los niveles de residuos de antibióticos de los CT.

Como muestra el Cuadro 6, la aparición de residuos de CT en productos lácteos (tamaño de muestra = 100) fue inferior al LMR (0,1 µg/ml). Los antibióticos detectados destacados fueron OXY y TTR con niveles inferiores al LMR en la mayoría de las muestras positivas. Respecto al total de residuos de antibióticos de CT, sólo 9 muestras (11,54%) excedieron el LMR. No se detectó CTC en ninguna de las muestras, lo que posiblemente se deba a que el límite de detección de este método (0,180 µg/mL) fue superior al LMR. Sin embargo, este hecho no está respaldado ya que las muestras positivas contienen otros antibióticos TC y el uso de CTC está restringido.

Los CT se utilizan comúnmente en medicina veterinaria como antibióticos o promotores del crecimiento. El uso inadecuado o la falta de protocolos claros de utilización pueden provocar la presencia de sus residuos en los productos ganaderos. Nuestro método HPLC-DAD muestra una mejora en los parámetros de resolución y sensibilidad que fue validado de acuerdo con las directrices de la ICH. Los porcentajes de recuperación son altos (85-100%) con efectos de matriz mínimos. Nuestro hallazgo indica que en la mayoría de las muestras de leche obtenidas del mercado saudita, los residuos de CT están por debajo del LMR para TTR y OXY. Las únicas excepciones fueron el 7,5% de las muestras que exceden el LMR de TTR y el 11,5% de las muestras que exceden el LMR para la suma de TTR y OXY, pero no para OXY sola. Nuestros datos reflejan la buena práctica clínica de estos dos CT en términos de uso en alimentación y tratamiento animal en Arabia Saudita. Nuestro método no era adecuado para la determinación de CTC en muestras de leche, ya que su límite de cuantificación es el doble del LMR. Por lo tanto, se necesita una mayor optimización de la sensibilidad para que el método pueda determinar los residuos de CTC en muestras de leche. Recomendamos el uso simultáneo de otras técnicas analíticas, como el inmunoensayo, en el seguimiento rutinario de los CT, así como ampliar las muestras utilizadas para incluir leche de granjas individuales y no comerciales para una investigación más detallada de la práctica de los períodos de espera y los protocolos de tratamiento.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado.

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Departamento de Química Farmacéutica, Facultad de Farmacia, Universidad Rey Saud, Riad, Arabia Saudita

Moneera N. Alnassrallah, Nourah Z. Alzoman y Aliyah Almomen

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Correspondencia a Nourah Z. Alzoman.

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Alnassrallah, MN, Alzoman, NZ y Almomen, A. Inmunoensayo cualitativo para la determinación de residuos de antibióticos de tetraciclina en muestras de leche seguido de un método HPLC-DAD cuantitativo mejorado. Representante científico 12, 14502 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18886-2

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Recibido: 26 de abril de 2022

Aceptado: 22 de agosto de 2022

Publicado: 25 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18886-2

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