Método de extracción QuEChERS miniaturizado para la detección de múltiples

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 7164 (2022) Citar este artículo

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La pérdida y fragmentación del hábitat se encuentran entre las mayores amenazas a la biodiversidad y la estabilidad de los ecosistemas, con implicaciones fisiológicas para la fauna silvestre. Los murciélagos (Microchiroptera) son pequeños mamíferos con una amplia variedad de hábitos alimentarios y el bienestar de estos animales se ve alterado por la exposición a pesticidas. Este estudio tuvo como objetivo desarrollar un método de extracción QuEChERS (rápido, fácil, económico, eficaz, resistente y seguro) miniaturizado para la detección de pesticidas de residuos múltiples en tejido muscular de murciélago mediante cromatografía de gases junto con espectrometría de masas (GC-MS). Se probaron un total de 48 pesticidas en 250 mg de tejido muscular de murciélago. El método analítico desarrollado se aplicó a 148 murciélagos recolectados en dos áreas diferentes del estado de Minas Gerais, región Sudeste de Brasil. El método presentó buena sensibilidad y permitió la determinación de residuos de 48 pesticidas en músculo de murciélago mediante GC-MS. El método de extracción miniaturizado hace que el análisis sea factible incluso cuando el volumen de muestra es limitado. Sin embargo, no se detectaron residuos de pesticidas en los murciélagos de las dos zonas investigadas.

La contaminación ambiental por pesticidas ejerce impactos tanto directos como indirectos sobre los ecosistemas1,2. Estos impactos incluyen una reducción de la biodiversidad3,4 y una disminución de la población de varias especies, incluidos los murciélagos2,5,6,7, las aves8 y los anfibios9,10. La determinación de la contaminación ambiental por plaguicidas puede proporcionar una evaluación del riesgo toxicológico de las especies evaluadas. La exposición de los animales a los pesticidas puede evaluarse mediante la determinación de los niveles de pesticidas residuales en los tejidos, generalmente realizada mediante cromatografía de gases combinada con espectrometría de masas (GC-MS), que permite la separación y detección de una mezcla de componentes con alta sensibilidad analítica11,12. Debido a la naturaleza compleja de las muestras y las bajas concentraciones de pesticidas presentes en animales con masa corporal pequeña, es crucial extraer y concentrar los analitos de interés durante la preparación de la muestra y al mismo tiempo eliminar posibles interferencias13.

El método de extracción Rápido, Fácil, Barato, Efectivo, Robusto y Seguro (QuEChERS) fue desarrollado como un método simple de múltiples residuos que se puede realizar en cualquier laboratorio, sin necesidad de equipos sofisticados14. Este método fue propuesto inicialmente para la extracción de residuos de plaguicidas de matrices vegetales; sin embargo, debido a su simplicidad y eficacia, ha sido adaptada y optimizada para su uso en otro tipo de matrices, incluidos tejidos animales15,16, leche17, miel18,19,20, agua21,22 y suelo23,24.

El método QuEChERS original requiere 10 g de muestra14, que no siempre está disponible para tamaños de muestra más pequeños. Por tanto, la miniaturización de QuEChERS es una técnica alternativa para analizar muestras pequeñas25,26,27. Además, el método miniaturizado utiliza menos reactivos y disolventes, es relativamente más económico y reduce el impacto ambiental en comparación con los métodos tradicionales28.

Los murciélagos (Microchiroptera) son pequeños mamíferos con una amplia variedad de hábitos alimentarios; por lo tanto, desempeñan un importante servicio ecosistémico en el mantenimiento de los biomas mediante la dispersión de semillas, la polinización y el control de poblaciones de insectos y pequeños vertebrados29. Los primeros informes sobre la mortalidad de murciélagos causada por pesticidas se publicaron a principios de la década de 195030,31. Otros estudios han informado sobre la exposición de los murciélagos a pesticidas, principalmente organoclorados, mediante la determinación de residuos y sus efectos, así como la determinación de dosis y concentraciones letales de los pesticidas2. Recientemente, ha habido un mayor interés en evaluar los efectos de la exposición prolongada a pesticidas2 en organismos vivos. Sin embargo, las evaluaciones de las poblaciones naturales siguen siendo escasas32,33.

La determinación de residuos de pesticidas en la mayoría de las especies de murciélagos es un desafío debido a sus pequeñas masas corporales: los animales individuales pueden pesar menos de 10 g34. Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar un método de extracción QuEChERS miniaturizado para detectar pesticidas con múltiples residuos en tejido muscular de murciélago mediante GC-MS. El método desarrollado utiliza menos reactivos y menos tejido de murciélago que las técnicas tradicionales.

Reactivos de grado analítico para análisis de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), incluidos acetonitrilo (JT Baker, México), acetato de etilo (JT Baker, México), hexano (Merck, Darmstadt, Alemania), aminas primarias y secundarias (PSA; Agilent, EE. UU.), octadecilsilano (C18; Agilent, Santa Clara, CA, EE. UU.), sulfato de magnesio (St. Louis, MO, EE. UU.) y acetona (Scharlau, Barcelona, España). Se obtuvo agua ultrapura utilizando un sistema de purificación Millipore Q UV3 (Merck, Milford, CT, EE. UU.). Los estándares analíticos de los pesticidas investigados fueron proporcionados (grado de pureza > 98,0%) por el Dr. Ehrenstorfer (Augsburg, Alemania) y AccuStandard (New Haven, CT, EE. UU.).

El diseño experimental y la colecta de animales fueron aprobados por el Comité de Ética en el Uso de Animales de la Universidad Federal de Minas Gerais (Protocolo CEUA 166/2017) y del Instituto Chico Mendes para la Conservación y la Biodiversidad (Protocolo ICMBio 57.026-1).

Para la recolección de murciélagos se eligieron dos áreas con diferentes presiones antrópicas: una en una zona rural del municipio de Uberaba, MG, Brasil (19°45′43'' S' y 48°06′05'' W), caracterizada por una intensa actividad agrícola. actividad35, y el otro en el Parque Nacional (PARNA) de Serra do Cipó, Santana do Riacho, MG, Brasil, una unidad de conservación federal brasileña36. Los murciélagos se recolectaron en 2018 y 2019 utilizando redes de niebla de 10 a 12 m de largo, que se abrieron al anochecer en senderos, fragmentos de bosque y en las cercanías de refugios diurnos. Las redes de niebla permanecieron abiertas durante aproximadamente 4 h (18:00 a 22:00 h) y fueron inspeccionadas a intervalos de 20 a 30 min. Los procedimientos de captura se realizaron de conformidad con la Sociedad Estadounidense de Mammalogistas37. Se recolectaron 148 murciélagos: 78 de la región agrícola de Uberaba y 70 de la unidad de conservación federal PARNA. Los animales fueron colocados en bolsas de tela individuales hasta que se realizó la eutanasia. Luego se colocó a los animales en una bolsa de plástico que contenía un algodón, que previamente se sumergió en isoflurano, para inducir la pérdida del conocimiento, seguido de una inyección intraperitoneal de un anestésico (clorhidrato de ketamina). Luego, los murciélagos se almacenaron en un congelador a -20 °C hasta su análisis.

La elección de los tejidos para el análisis cromatográfico se basó en estudios previos, que indicaron que se pueden encontrar mayores concentraciones de pesticidas y otros residuos xenobióticos en el hígado, la grasa y los tejidos musculares38,39,40. En consecuencia, debido a que los murciélagos tienen poca grasa, se utilizó el músculo como matriz debido a su gran abundancia41. Sin embargo, debido a que el hígado era insuficiente para el análisis, especialmente en especies más pequeñas, se recolectaron fragmentos de grasa e hígado de murciélagos más grandes para realizar un análisis comparativo entre diferentes tipos de tejidos.

Se compararon dos métodos de extracción, utilizando 1,0 g (método A) y 250 mg (método B) de tejido muscular de murciélago.

El método A se basa en un método de extracción QuEChERS modificado descrito por Oliveira et al.15. Se añadieron agua (3,6 ml), acetonitrilo (5,0 ml) y acetato de etilo (2,14 ml) a 1,0 g de muestra y la mezcla se agitó durante 1 min a 2200 rpm. A esto le siguió la adición de MgSO4 (2,86 mg) y acetato de sodio (0,71 mg), que luego se homogeneizaron en un vórtex durante 1 min a 2200 rpm y se centrifugaron durante 11 min a 4000 rpm. Luego las muestras se mantuvieron a -20 °C durante la noche. A continuación, las muestras se centrifugaron durante 5 min a 4000 rpm y posteriormente el extracto (1,0 ml) se transfirió a un tubo de microcentrífuga que contenía MgSO4 (150 mg), PSA (30 mg) y C18 (30 mg). Después de agitar a temperatura ambiente (durante 1 min a 2200 rpm) y centrifugar (durante 12 min a 9000 rpm), el sobrenadante se inyectó en el instrumento GC-MS.

El método B se basa en el método de extracción QuEChERS miniaturizado propuesto por Brandhonneur et al.25. Las muestras se descongelaron y se extrajeron fragmentos del músculo pectoral (250 mg), se deshidrataron y homogeneizaron con MgSO4 (400 mg). A cada muestra se le añadieron acetonitrilo (1,4 ml), hexano (200 µl) y azoxistrobina (1,2 ng/ml, para control del proceso). Las muestras se agitaron durante 5 minutos a 2200 rpm y se colocaron en un congelador a -20 °C durante 30 minutos. Luego las muestras se centrifugaron durante 20 min a 5000 rpm. A continuación, se transfirió la fase orgánica (800 µL) a un tubo de microcentrífuga que contenía MgSO4 (100 mg), PSA (50 mg) y C18 (50 mg). Después de agitar durante 1 min a 2200 rpm, las muestras se colocaron en un agitador durante 10 min a temperatura ambiente y luego se centrifugaron durante 12 min a 12000 rpm a 10 °C. La fase orgánica (150 µL) se transfirió a un vial equipado con un inserto para evaporar el disolvente a temperatura ambiente. Las muestras se reconstituyeron con acetona (75 µl), se agitaron durante 30 segundos a 2200 rpm y luego se inyectó la solución (8 µl) en el instrumento GC-MS.

Como control del proceso se utilizó azoxistrobina (estándar de lote G128076 del Dr. Ehrenstorfer, Alemania) en acetonitrilo (1,2 ng/ml). Todas las muestras, incluidas las muestras blancas (muestras sin enriquecimiento), se fortificaron con 440 µl de azoxistrobina (1,2 ng/ml). La extracción se consideró satisfactoria cuando la tasa de recuperación de azoxistrobina varió entre 80 y 110%42.

Después de determinar el mejor método de extracción (A o B), el fragmento de músculo de murciélago se fortificó con una solución madre de pesticida y se extrajo para determinar el tiempo de retención (RT) y los iones para el modo de cromatografía de monitoreo de iones (SIM) seleccionado.

Los análisis cromatográficos se realizaron utilizando un instrumento GC-MS (Agilent 7890A-5975C) equipado con un muestreador automático (Agilent Sampler 80). La separación cromatográfica se realizó utilizando una columna capilar DB-5 (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm; Agilent Technologies, EE. UU.) con He (99,999 %; Air Products, Brasil) como gas portador a un caudal de 1,2 ml/min. . Las condiciones cromatográficas incluyeron una temperatura del inyector de 250 °C, un volumen de inyección de 8 µL en modo splitless, una rampa de temperatura de la columna de 60 a 160 °C con tres rampas de velocidad de calentamiento de 20 °C/min, seguidas de un aumento a 255 °C. C a 5 °C/min, y luego una rampa de 20 °C/min hasta una temperatura final de 280 °C, que se mantuvo durante 7 min. El tiempo post-ejecución fue de 2 min a 280 °C, con un caudal de He de 2,6 ml/min. El tiempo total de ejecución cromatográfica fue de 32,25 min. La jeringa de inyección se lavó tres veces con acetona-agua (1:1 v/v) y acetonitrilo entre las inyecciones. El espectrómetro se ajustó a un voltaje de ionización de impacto de 70 eV, una temperatura de la fuente de ionización de 230 °C, una temperatura del cuadrupolo de 150 °C y una temperatura de interfaz de 300 °C.

El software utilizado para la adquisición de datos fue MSD ChemStation. La adquisición de datos comenzó a los 3,5 min en el modo de escaneo completo, con un rango de masa entre 50 y 450 m/z en el modo SIM. Los pesticidas se confirmaron comparando los resultados con los datos de la base de datos de la biblioteca del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST). Se utilizó el modo SIM para la identificación de compuestos en soluciones estándar, y los iones y RT monitoreados se enumeran en la Tabla 1.

Se utilizó una solución madre estándar que contenía 69 pesticidas. Se inyectaron mil microlitros de la solución madre en acetonitrilo-acetato de etilo (7:3 v/v) en el instrumento GC-MS. Las soluciones de trabajo de cada pesticida se enumeran en la Tabla 2.

Inicialmente, se inyectó 1 µL de estándares de pesticidas en acetato de acetonitrilo usando un revestimiento splitless, a una temperatura del inyector de 250 °C, y gas portador a un caudal de entre 1,0 y 1,2 ml/min.

Se aplicaron cuatro condiciones de rampa de temperatura del horno para determinar las condiciones óptimas para una mejor sensibilidad analítica, como se describe a continuación.

Condición 1: Una temperatura inicial de la columna de 80 °C, seguida de una velocidad de calentamiento de 20 °C/min hasta 160 °C, un aumento a 255 °C a 5 °C/min y una rampa de 20 °C/min. min hasta una temperatura final de 280 °C, que se mantuvo durante 1 min. El tiempo total de ejecución fue de 25,25 min.

Condición 2 (adaptado de Maštovská et al.43): una temperatura inicial de la columna de 80 °C, mantenida durante 1,5 min, seguida de una rampa de calentamiento de 20 °C/min hasta 180 °C, un aumento a 230 °C a 5 °C/min, y una rampa de 25 °C/min hasta alcanzar una temperatura final de 290 °C, la cual se mantuvo durante 10 min. El tiempo de ejecución total fue de 28,9 min.

Condición 3 (adaptado de Faria et al.44): La rampa de temperatura de la columna comenzó a 60 °C, que se mantuvo durante 1 min, seguida de una velocidad de calentamiento de 30 °C/min hasta 180 °C, un aumento a 300 °C a 5 °C/min, y una rampa de 50 °C/min hasta una temperatura final de 325 °C, que se mantuvo durante 2 min. El tiempo de ejecución total fue de 29,5 min.

Condición 4 (adaptado de Valenzuela et al.45): una temperatura inicial de la columna de 60 °C, seguida de una velocidad de calentamiento de 20 °C/min hasta 160 °C, un aumento a 255 °C a 5 °C/min , y una rampa de 20 °C/min hasta una temperatura final de 280 °C, que se mantuvo durante 7 min. El tiempo total de ejecución fue de 32,25 min.

Las rampas de temperatura se optimizaron utilizando volúmenes de inyección de 2, 5 y 8 µl. La evaluación de la degradación de pesticidas en el sistema de inyección se realizó a temperaturas del inyector de 100, 150, 200 y 250 °C.

El límite de detección (DL) se calculó multiplicando la desviación estándar (SD) por tres46. La DE se obtuvo evaluando 10 muestras blancas (extractos obtenidos únicamente de músculo de murciélago) y registrando la abundancia correspondiente al TR de cada pesticida. Un murciélago capturado en PARNA Serra do Cipó fue utilizado exclusivamente para calcular el DL. La muestra procedía de la zona de referencia; por lo tanto, no se esperaban altas concentraciones de residuos de pesticidas. También se eligió un murciélago más grande porque tiene más tejido muscular. En consecuencia, se prepararon 10 extractos para las mediciones y cálculo de la DE. Se esperaba poca variación en los valores obtenidos debido a que las muestras fueron extraídas del mismo individuo; las variaciones se atribuyeron a las limitaciones del instrumento y métodos de extracción.

Luego de determinar el mejor método de extracción, se calculó la recuperación para observar las posibles pérdidas ocurridas durante el proceso analítico47,48. Se utilizaron dos fragmentos de músculo de murciélago capturado en PARNA Serra do Cipó. Un fragmento se fortificó con una solución madre de pesticidas que contenía 69 pesticidas antes de la extracción y el otro se fortificó después de la extracción. Posteriormente, ambos fragmentos fueron sometidos a corridas cromatográficas para determinar los analitos y los valores de recuperación estimados. La recuperación indica la cantidad de analito detectado en relación con la cantidad añadida a la muestra. Pueden ocurrir variaciones en los valores debido a efectos de la matriz y pérdida de analitos debido a la degradación en el sistema de inyección o procedimiento de extracción (limpieza, dilución, secado o preconcentración).

El verdor del método desarrollado se determinó utilizando los sistemas métricos Índice de Procedimiento Analítico Verde (GAPI)49 y Analytical EcoScale (AES)50.

El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y las directrices ARRIVE, y fue aprobado por el Comité de Ética en el Uso de Animales de la Universidad Federal de Minas Gerais (Protocolo CEUA 166/2017) y por el Instituto Chico Mendes para la Conservación y la Biodiversidad ( Protocolo ICMBio 57.026-1). el estudio se informa de acuerdo con.

Todos los autores aceptaron participar en la publicación.

El método QuEChERS miniaturizado (Método B) presentó los resultados óptimos para la extracción ya que produjo picos discernibles y menos ruido en los espectros. Posteriormente, se optimizaron la extracción de la muestra, el método de limpieza y las condiciones cromatográficas. Se probaron cuatro rampas de temperatura del horno (Condiciones 1 a 4), y las Condiciones 1 y 4 mostraron los mejores resultados. Estas condiciones se probaron nuevamente con un volumen de inyección de 2 µL. Se eligió la condición 4 porque tenía menos ruido y una mejor definición de pico (Fig. 1). Luego se probó el método elegido utilizando volúmenes de inyección de 5 y 8 µl. Un volumen de inyección de 8 µL resultó en la detección de una mayor cantidad de pesticidas.

Cromatograma de una muestra de músculo de murciélago en blanco enriquecida con 69 pesticidas obtenida mediante cromatografía de gases acoplada con espectrometría de masas (GC-MS) en modo de escaneo completo usando la Condición 4 (temperatura inicial de la columna de 60 °C, seguida de una velocidad de calentamiento de 20 °C/ min hasta 160 °C, un aumento a 255 °C a 5 °C/min y una rampa de 20 °C/min hasta una temperatura final de 280 °C, que se mantuvo durante 7 min; el tiempo total de ejecución fue de 32,25 mín.).

Para determinar si se produjo degradación del pesticida en el sistema de inyección, también se probaron temperaturas del inyector de 100, 150, 200 y 250 °C.

Para la adquisición de datos, se detectaron tres transiciones iónicas para cada pesticida en sus respectivas RT utilizando este método. Los pesticidas se identificaron y confirmaron comparando los espectros de masas obtenidos en el modo de escaneo completo con la biblioteca del NIST51. Se aplicó una probabilidad mínima del 70% entre el espectro obtenido en modo de escaneo completo y la base de datos de la biblioteca para confirmar la identificación del analito. Este porcentaje se consideró adecuado porque las pruebas se realizaron utilizando estándares analíticos. Las diferencias en probabilidad se obtuvieron comparando los espectros obtenidos en los modos SIM y de escaneo completo. Estas diferencias se producen porque es posible ver todos los iones presentes en el modo de escaneo completo, mientras que en el modo SIM solo se muestran los iones seleccionados. En el espectro SIM, el analito se cuantificó estimando el área del pico correspondiente. Las estimaciones de DL se enumeran en la Tabla 3.

Los valores de recuperación oscilaron entre 35,3 y 97,6%. Según la Asociación de Químicos Analíticos Oficiales48, el rango recomendado de porcentajes de recuperación para analitos a una concentración de 1 ppb varía del 40 al 120%48. Siete pesticidas (trifluralina, HCH alfa, HCH beta, endosulfán I, dieldrín, bifentrina y lambda-cialotrina) mostraron valores de recuperación fuera del rango recomendado (Tabla 3). Sin embargo, como se utilizó la biblioteca NIST como método de confirmación, solo el endosulfán I y la lambda-cialotrina no mostraron una recuperación aceptable. Por lo tanto, el método de extracción que desarrollamos arrojó resultados satisfactorios.

El método desarrollado se evaluó en cuanto a verdor utilizando GAPI y AES. Los parámetros de estimación del GAPI se presentan en la Tabla 4 y se muestra un pictograma en la Fig. 2. Para la evaluación de verdor utilizando AES, el método obtuvo una puntuación de 80 (Tabla 5), lo que indica un excelente análisis de verde.

Pictograma de evaluación del Índice de Procedimiento Analítico Verde (GAPI) del método analítico desarrollado.

No se detectaron residuos de pesticidas por encima de los DL en los tejidos musculares de murciélagos de Uberaba y PARNA Serra do Cipó. Asimismo, no se detectaron residuos de pesticidas en los extractos obtenidos del hígado y del tejido adiposo.

En este estudio, desarrollamos un método para determinar los residuos de 48 pesticidas en el músculo de murciélago mediante GC-MS. Un método QuEChERS miniaturizado adaptado de Brandhonneur et al.25 presentó resultados óptimos ya que produjo picos discernibles y menos ruido inicial. La miniaturización del método hace que el análisis sea factible incluso cuando la cantidad de muestra es limitada. Además, utiliza menos reactivos que los métodos tradicionales, reduciendo tanto el coste como el impacto en el medio ambiente y la salud de los investigadores.

El acetonitrilo es uno de los disolventes de extracción más utilizados porque permite la extracción de muchos pesticidas y minimiza la extracción de lípidos, carbohidratos y proteínas que están presentes en la matriz52. Los lípidos son compuestos que merecen mayor atención porque pueden comprometer la calidad de los resultados y además pueden depositarse en el sistema de inyección o columna cromatográfica, dañando el sistema cromatográfico53. El hexano agregado al proceso de extracción ayuda a la eliminación de compuestos lipófilos porque estos compuestos son menos solubles en acetonitrilo54. Las sales secantes, como el sulfato de magnesio (MgSO4) y el sulfato de sodio (Na2SO4), eliminan el agua residual de la solución y facilitan la eliminación de los componentes polares de la matriz14,52,55. En este trabajo utilizamos MgSO4 porque tiene mayor poder de secado que el Na2SO452. Además, el calor liberado durante la reacción química de hidratación del MgSO4 puede contribuir a la extracción de pesticidas14.

Además, utilizamos sorbentes PSA y C18 para eliminar los inhibidores coextraídos de la matriz14,56,57 durante la limpieza de la muestra. El PSA tiene una estructura bidentada que ejerce un efecto quelante, lo que permite la retención de ácidos grasos libres, carbohidratos y otros compuestos polares presentes en la matriz14, mientras que el C18 es importante para la eliminación de ácidos grasos y otros componentes no polares56.

De acuerdo con la guía de validación de métodos y procedimientos de control de calidad para el análisis de residuos de plaguicidas, para que el análisis por CG-MS con un analizador de masas cuadrupolo simple sea válido, los datos deben adquirirse en el método de escaneo completo, con un rango limitado. de m/z y monitoreo en modo SIM de tres iones46. En el modo de escaneo completo, se realizó un escaneo masivo completo en el rango de 50 a 450 m/z, generando un espectro completo que contenía más de una sustancia a la misma RT. Este modo de adquisición de datos es menos sensible cuando los analitos están presentes en concentraciones bajas, mientras que hay altas concentraciones de interferencias de la matriz58,59. La sensibilidad y selectividad del método se pueden mejorar utilizando el modo SIM, en el que el analizador de masas está programado para monitorear solo los iones característicos de los compuestos estudiados59.

El método desarrollado permitió la detección de 48 pesticidas mediante GC-MS. Se han utilizado otros métodos para detectar pesticidas en murciélagos32,33. Valdespino y Sosa33 también identificaron 19 pesticidas organoclorados mediante GC-MS. Stecherts et al.32 analizaron 25 pesticidas organoclorados, organofosforados y piretroides en cadáveres de murciélagos utilizando tres sistemas cromatográficos diferentes (GC/ECD, HPLC/DAD y LC/MS/MS). Así, el método descrito en este estudio permite la detección de un mayor número de pesticidas. Además, ambos métodos antes mencionados requirieron el uso de todo el cadáver del murciélago, mientras que nuestro método utilizó solo 250 mg de músculo de murciélago, lo que permitió el uso del resto del animal para otros análisis, lo que presenta una gran ventaja para futuros estudios de toxicología ambiental.

Estudios anteriores evaluaron la exposición de murciélagos insectívoros mediante la determinación de residuos de insecticidas organoclorados y organofosforados2. Sin embargo, no se detectó ningún pesticida residual por encima de los DL en murciélagos de Uberaba o PARNA Serra do Cipó. PARNA Serra do Cipó es una unidad de conservación de protección integral que no está rodeada de actividades agrícolas intensivas36. En contraste, Uberaba es uno de los principales municipios del estado de Minas Gerais que produce granos y caña de azúcar35, y el uso de pesticidas para estos cultivos es mayor que el de otros cultivos en Brasil60. La literatura sobre la contaminación ambiental por plaguicidas en estos municipios es escasa. Sin embargo, los análisis del suministro de agua a los habitantes de la ciudad han revelado contaminación por alaclor, atrazina, carbendazim, clordano, DDT, DDD, DDE, diurón, glifosato, lindano, mancozeb, permetrina, trifluralina, 2,4-D, 2,4, 5-T, aldicarb, aldrín, carbofurano, clorpirifos, endosulfán, endrín, metamidofos, metalaclor, molinato, metil paratión, pendimentalina, profenofos, simazina, tebuconazol y terbufos61. Por lo tanto, aunque no se detectaron residuos de pesticidas, es razonable suponer que los murciélagos de Uberaba están expuestos a la contaminación ambiental por pesticidas, con concentraciones inferiores a las definidas en las DL.

El verdor del método analítico desarrollado se estimó utilizando dos sistemas métricos: GAPI49 y AES50. GAPI es un análisis cualitativo que mide 15 parámetros que se dividen en tres categorías: I, preparación de muestras (recolección, preservación, transporte, almacenamiento, tipo de método, escala de extracción, solventes/reactivos utilizados y tratamientos adicionales); II, reactivos y disolventes (cantidad, peligro para la salud y peligro para la seguridad); y III, evaluación de la instrumentación (consumo de energía, riesgos laborales, residuos producidos y tratamiento de residuos). Cada parámetro está codificado por colores según el impacto ambiental estimado de la siguiente manera: bajo (verde), medio (amarillo) o alto (rojo); y los resultados se presentan como un pictograma formado por cinco pentágonos49,62. El pictograma GAPI para el método descrito en este documento mostró un impacto ambiental estimado más bajo que los de los métodos QuEChERS anteriores63.

En este estudio, utilizamos el sistema métrico AES50 para evaluar el carácter ecológico del método desarrollado. AES se basa en EcoScale, un análisis semicuantitativo para medir los impactos ecológicos, económicos y de seguridad de los métodos de síntesis orgánica64. Las puntuaciones de los atributos AES para el método analítico varían de 0 a 100. Los puntos de penalización se calculan en función de las cantidades de reactivos y los peligros, el consumo de energía, los riesgos laborales y los desechos, que luego se restan de la puntuación máxima de 100. Los excelentes métodos analíticos ecológicos tienen puntuaciones puntuaciones superiores a 75 y puntuaciones superiores a 50 se consideran aceptables50,62. El método descrito en este estudio obtuvo una puntuación de 80, lo que indica un excelente análisis en verde.

En resumen, el método analítico utilizado en este estudio permitió la identificación de 48 pesticidas diferentes presentes en el músculo de murciélago mediante GC-MS. Sin embargo, no se detectaron residuos de pesticidas en los 148 murciélagos analizados de las dos áreas diferentes.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a solicitud razonable.

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Esta investigación fue financiada por la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais—FAPEMIG, subvención número APQ-01705-18, y el Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico—CNPq, subvención número 311182/2017-8.

Departamento de Clínica y Cirugía Veterinaria, Facultad de Veterinaria, Universidad Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, MG, Brasil

Camila Guimarães Torquetti y Benito Soto Blanco

Departamento de Análisis Clínicos y Toxicológicos, Facultad de Farmacia, Universidad Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, MG, Brasil

Mirna Maciel d'Auriol-Souza y Leiliane Coelho André

Laboratorio de Investigaciones Biológicas, Centro de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Estatal del Oeste de Paraná (Unioeste), Cascavel, PR, Brasil

Ana Tereza Bittencourt Guimarães

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Conceptualización: CGT, ATBG, BSB Colección de muestras: CGT Análisis: CGT, MMAS, LCA Escritura, revisión y edición: CGT, ATBG, BSB Todos los autores revisaron el manuscrito. Todos los autores dieron su consentimiento para la publicación.

Correspondencia a Benito Soto Blanco.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Guimarães Torquetti, C., Maciel d'Auriol-Souza, M., Coelho André, L. et al. Método de extracción QuEChERS miniaturizado para la detección de pesticidas multiresiduos en tejido muscular de murciélago. Representante científico 12, 7164 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11352-z

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Recibido: 09 de diciembre de 2021

Aceptado: 22 de abril de 2022

Publicado: 03 de mayo de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11352-z

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