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Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 10693 (2022) Citar este artículo

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Las enfermedades infecciosas se encuentran entre las principales causas de mortalidad en todo el mundo. En 2019 se identificó en Wuhan, China, un nuevo coronavirus denominado corona virus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2), y la Organización Mundial de la Salud (OMS) declaró su brote, la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19), como una Pandemia mundial en 2020. El COVID-19 puede propagarse rápidamente de persona a persona. Una de las cuestiones más desafiantes es identificar a las personas infectadas y prevenir la posible propagación del SARS-CoV-2. Recientemente, las pruebas de anticuerpos inmunoglobulina M (IgM) e inmunoglobulina G (IgG) anti-SARS-CoV-2 mediante métodos inmunocromatográficos se han utilizado como complemento a los métodos de detección actuales y han proporcionado información del curso aproximado de la infección por COVID-19. Sin embargo, la extracción de sangre causa dolor y presenta riesgos de infección en el lugar de la punción de la aguja. En este estudio, se desarrolló un nuevo sensor de parche que integra microagujas porosas y un ensayo inmunocromatográfico (PMNIA) para la detección rápida de IgM/IgG anti-SARS-CoV-2 en el líquido intersticial dérmico (ISF), que es una rica fuente de proteínas. biomarcadores, como los anticuerpos. Se fabricaron microagujas (MN) porosas biodegradables hechas de ácido poliláctico para extraer ISF de la piel humana mediante efecto capilar. El ISF extraído se transportó verticalmente y fluyó hacia el biosensor de inmunoensayo fijado, donde se pudieron detectar colorimétricamente anticuerpos específicos in situ. Los anticuerpos IgM/IgG anti-SARS-CoV-2 se detectaron simultáneamente en 3 minutos in vitro. Además, el límite de detección de concentraciones de IgM e IgG anti-SARS-CoV-2 fue tan bajo como 3 y 7 ng/ml, respectivamente. Se espera que el dispositivo desarrollado que integra MN porosos y biosensores inmunocromatográficos permita pruebas de anticuerpos IgM/IgG anti-SARS-CoV-2 mínimamente invasivas, simples y rápidas. Además, el tamaño compacto del MN y del dispositivo integrado con biosensor es ventajoso para su uso generalizado. El dispositivo propuesto tiene un gran potencial para la detección rápida de diversas enfermedades infecciosas además de COVID-19 como método complementario eficaz con otras pruebas de diagnóstico.

A finales de 2019, se identificó un nuevo coronavirus, el coronavirus 2 del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV-2), que causa la enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). Se propagó por todo el mundo en 3 meses debido a su alta infectividad1,2. En marzo de 2020, la Organización Mundial de la Salud (OMS) anunció el brote de COVID-19 como una pandemia global3. Una infección por COVID-19 se transmite rápidamente de persona a persona y sus síntomas incluyen fatiga, tos, fiebre, disnea, anosmia y ageusia; Los síntomas más graves incluyen insuficiencia respiratoria, que puede poner en peligro la vida4,5. Además, se informa que la tasa de infecciones asintomáticas oscila entre el 16% y el 38%, lo que dificulta la identificación de todas las personas infectadas con SARS-CoV-26. Las vacunas contra la COVID-19 son eficaces para reducir el riesgo de infección y la transmisión del virus; sin embargo, la proporción de población completamente vacunada contra la COVID-19 sigue siendo inferior al 10 % en varios países de bajos ingresos7,8. Por lo tanto, uno de los desafíos globales actuales es identificar a los pacientes tanto sintomáticos como asintomáticos lo antes posible para prevenir la posible propagación del SARS-CoV-2.

Actualmente, la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (RT-PCR) es el método de detección predominante y sigue siendo el estándar de oro para el diagnóstico de COVID-199. Sin embargo, existen ciertos inconvenientes asociados con este método que impiden la detección rápida de COVID-19: (1) se necesita una infraestructura de laboratorio sustancial e instalaciones bien equipadas para realizar RT-PCR en tiempo real; (2) se requieren técnicos médicos bien capacitados para recolectar muestras de hisopos naso u orofaríngeos y operar instrumentos de laboratorio sofisticados; (3) el tiempo total de respuesta para las pruebas de RT-PCR en tiempo real es largo (4 a 6 h), lo que plantea un riesgo de contaminación cruzada10. Por lo tanto, al ser costoso, consumir mucho tiempo y requerir personal médico, utilizar el diagnóstico de COVID-19 por RT-PCR en tiempo real no es factible en muchos países con recursos limitados.

Además de detectar el SARS-CoV-2 en muestras tomadas de la parte posterior de la nariz y la garganta, la prueba de anticuerpos inmunoglobulina M (IgM) e inmunoglobulina G (IgG) anti-SARS-CoV-2 es una buena alternativa para la confirmación de COVID. -19 infección11,12,13. Según investigaciones anteriores, las IgM e IgG generadas por el SARS-CoV-2 se pudieron detectar en el 31,8% y el 40,9% de los pacientes entre 0 y 5 días después del inicio de los síntomas14, mientras que el 94% y el 100% de los pacientes dieron positivo en las pruebas anti-SARS. -CoV-2 IgM e IgG, respectivamente, dentro de las 3 semanas posteriores al inicio de los síntomas15. Además, la etapa de la infección por COVID-19 se puede conocer aproximadamente, porque el anticuerpo IgM anti-SARS-CoV-2 es la primera respuesta de anticuerpos a la exposición inicial a los antígenos del SARS-CoV-2, que aumenta una semana después de la aparición de los síntomas y alcanza su punto máximo. después de 2 a 3 semanas, y luego disminuye a un nivel bajo en la mayoría de los pacientes16. Por el contrario, se observó una meseta en el nivel de IgG 3 semanas después del inicio de los síntomas, y el nivel alcanzó su punto máximo entre 3 y 8 semanas y se mantuvo en un nivel alto durante un largo tiempo16. Por tanto, la detección tanto de IgM como de IgG puede proporcionar información concluyente sobre el curso aproximado de la infección por COVID-19. Además, según el estudio anterior sobre la IgG del dominio de unión al receptor de la proteína de pico (RBD) anti-SARS-CoV-2 en muestras de sangre, su concentración osciló entre 331 y 25,7 µg/ml después de la aparición de los síntomas17, mientras que la concentración de la IgG objetivo en el suero de convaleciente fue de 7 a 2100 ng/ml18. Además, la IgM contra el pico RBD del SARS-CoV-2 en plasma/suero indicó una concentración similar a la de IgG después de la aparición de los síntomas19. Hoy en día, las tiras de ensayo inmunocromatográfico de flujo lateral (LFIA) basadas en nanopartículas de oro (AuNP) se están utilizando ampliamente para la detección rápida de anticuerpos específicos del SARS-CoV-220,21,22,23,24,25,26. Por lo general, cuando se utiliza el LFIA de autoevaluación de COVID-19, las personas deben recolectar su muestra de sangre utilizando un dispositivo de punción y luego pipetearla inmediatamente en el pozo de muestra del casete27. Luego, se agregan 2 a 3 gotas de tampón de proceso al pocillo de la muestra para diluir la muestra. La muestra de sangre diluida fluye a través de la tira reactiva y la etiqueta colorimétrica se puede leer en 10 a 20 minutos. Debido a su funcionamiento sencillo y a que no requieren instrumentos ni pasos complejos, las tiras LFIA para probar anticuerpos anti-SARS-CoV-2 se han convertido en una plataforma confiable para pruebas en el lugar de atención (POC) en muchos países. Más importante aún, los anticuerpos específicos del SARS-CoV-2 podrían detectarse en pacientes asintomáticos, así como en personas con resultados negativos de RT-PCR que tuvieron contactos cercanos con pacientes infectados por COVID-1915 y, por lo tanto, la detección de anticuerpos objetivo puede usarse como una complemento a las pruebas RT-PCR en tiempo real. Sin embargo, el sangrado causado por un pinchazo en el dedo puede causar dolor y aumentar el riesgo de infección o incluso contaminación cruzada28. Además, los pacientes deben deshacerse de los componentes del kit de prueba, que son un residuo potencialmente biopeligroso. Por lo tanto, se necesitan con urgencia métodos mínimamente invasivos y fáciles de usar para lograr una detección rápida de anticuerpos específicos del SARS-CoV-2.

En las últimas décadas, ha habido una tendencia creciente hacia el uso de microagujas (MN). En 1998, los MN se desarrollaron inicialmente para demostrar la viabilidad de la administración transdérmica de fármacos indolora29. La estructura de tamaño micro de los MN les permite penetrar la piel humana sin estimular las terminaciones nerviosas, lo que hace que el proceso sea indoloro con un cumplimiento mínimo y mejor por parte del paciente30. Recientemente, los MN han surgido como una poderosa plataforma para el muestreo de líquido intersticial (ISF), así como para la biodetección y monitorización de varios tipos de biomarcadores, como la glucosa31,32,33,34, el colesterol35,36 y los biomarcadores de proteínas37,38,39. Hasta ahora, se han desarrollado MN huecos, hinchables y porosos para la extracción de ISF. Sin embargo, los MN huecos con un conducto interno suelen estar hechos de silicio40, metal36 o polímero no disolvente38,41; por lo tanto, si se penetran en la piel, pueden dañar el cuerpo humano. Los MN hinchables generalmente requieren un posprocesamiento para recuperar el analito objetivo mediante centrifugación o extracción con disolvente34,35. Aquí, los MN porosos podrían resolver esos problemas. Recientemente, se han centrado los MN porosos con microsporas interconectadas dentro de toda la estructura del MN. En una década se han desarrollado MN porosos para recolectar el ISF dérmico, mientras que se han utilizado con éxito varios polímeros biocompatibles y biodegradables para fabricar estructuras porosas42. La extracción del ISF se puede realizar mediante acción capilar debido a estructuras porosas del tamaño de una micra y, además, un dispositivo de biodetección de laboratorio en chips se puede fijar directamente a los MN porosos para su posterior análisis y diagnóstico de enfermedades31,43. Por lo tanto, se puede diseñar e integrar un biosensor de inmunoensayo con MN porosos para la detección simple y rápida de anticuerpos IgM e IgG contra el SARS-CoV-2 en el ISF. Sin embargo, debido a los continuos vacíos dentro del MN, la estructura del MN es más frágil y, por lo tanto, existe un equilibrio entre la porosidad y la resistencia mecánica.

Con diferencia, el muestreo de sangre ha sido predominante en el análisis ex vivo. Se han utilizado otros biofluidos periféricos como lágrimas, sudor, saliva y orina como fuentes de muestra alternativas, pero el nivel de biomarcadores indicó una correlación deficiente con el de la sangre34,44. Sin embargo, otros fluidos corporales como el ISF, que se encuentra en las capas de epidermis y dermis de la piel humana, no han sido ampliamente adoptados en aplicaciones médicas debido a las dificultades en el muestreo mínimamente invasivo y la recolección suficiente para el posterior análisis ex vivo39,44. Mientras tanto, se informa que el ISF, ubicado principalmente en las capas de epidermis y dermis de la piel humana, contiene una amplia gama de metabolitos y proteínas (p. ej., anticuerpos) que demuestra una estrecha correlación con los de la sangre13,37. Además, se ha informado que el nivel de anticuerpos en el FSI es aproximadamente del 15 al 25 % del nivel de sangre45. Por lo tanto, se supone que la concentración de anticuerpos IgM/IgG anti-SARS-CoV-2 en el FIS está en el rango de 1 a 6,4 µg/ml, y es factible detectar IgM e IgG objetivo en el FIS para sustituir el muestreo de sangre. .

En este estudio, desarrollamos un nuevo sensor de parche (tamaño: 1,5 cm × 3,5 cm) que integra MN porosos biodegradables y un ensayo inmunocromatográfico (PMNIA) para una detección rápida, indolora, fácil de usar y simultánea de anti-SARS-CoV-2. Anticuerpos IgM e IgG en FIS. La innovación de nuestro dispositivo recientemente desarrollado se materializa en dos aspectos. Primero, logramos la detección de anticuerpos sin muestreo de sangre y proponemos un nuevo enfoque para fabricar MN porosos biodegradables con gotas de emulsión. Se utilizaron microesferas de ácido poliláctico (PLA) preparadas a partir de una única emulsión para formar microporos continuos y se sometieron a un tratamiento térmico para unirlos. Además, encontramos que los MN porosos mostraron una extracción óptima del fluido de la muestra por efecto capilar y una penetración efectiva en la piel después de 30 minutos de calentamiento a 180 °C. En segundo lugar, se desarrolló un biosensor de inmunoensayo de oro coloidal basado en papel de nuevo diseño. Cuando se transporta desde los MN porosos a la plataforma de biodetección, el ISF muestreado podría fluir vertical y autónomamente desde la almohadilla de muestra (capa inferior), la almohadilla de conjugado, la membrana de nitrocelulosa (NC) (capa superior) y finalmente hasta la almohadilla de absorción por acción capilar. , y la prueba de anticuerpos se completó en 3 minutos mediante observación visual de las bandas coloreadas. Además, el límite de detección (LoD) del dispositivo propuesto fue de 3 ng/ml para IgM y 7 ng/ml para IgG, lo que muestra las ventajas de la detección rápida de COVID-19 sobre los LFIA comerciales actuales.

El dispositivo de diagnóstico consistió en una matriz MN porosa biodegradable y un novedoso biosensor inmunocromatográfico de oro coloidal. En la Fig. 1a se muestra una descripción estructural del dispositivo ensamblado y se puede unir a la parte anterior del antebrazo, que carece de vello corporal y facilita la penetración de MN46. Además, la flexibilidad del parche MN poroso fabricado le permite adaptarse bien a la curvatura de la piel humana. Brevemente, el ISF se extrajo mediante MN porosos y se transportó verticalmente al biosensor inmunocromatográfico en el orden de la almohadilla de muestra, la almohadilla de conjugado y un extremo de la membrana NC, y luego fluyó lateralmente a través de toda la tira de la membrana NC, donde se detectó la presencia o ausencia de Se detectó y observó colorimétricamente IgM/IgG anti-SARS-CoV-2.

Diseño de PMNIA para la detección de COVID-19. (a) Fotografía de una descripción general estructural del dispositivo de detección y una vista ampliada del dispositivo que comprende la matriz porosa de MN y los componentes del biosensor inmunocromatográfico basado en papel. La imagen insertada muestra la matriz MN porosa con un sustrato flexible. (b) Diagrama esquemático del principio PMNIA para la detección simultánea de IgM/IgG anti-SARS-CoV-2. (c) Ilustración de la interpretación de los diferentes resultados de detección utilizando PMNIA.

La matriz porosa de MN se fabricó a partir de microesferas de PLA preparadas mediante una única emulsión y posteriormente se sometió a un tratamiento térmico para formar microporos interconectados para absorber y transportar ISF por efecto capilar. El PLA es un polímero con buena biocompatibilidad y biodegradabilidad que no daña el cuerpo humano y se emplea ampliamente en aplicaciones biomédicas47. El tamaño de la matriz porosa de MN fue de 1,5 cm × 1,5 cm con los MN alineados en una matriz de 13 × 13 para absorber la muestra ISF para biodetección. Luego, la matriz porosa de MN se fijó a una membrana hidrófoba (espesor: 38 µm) con un orificio (1 cm x 1 cm) para transportar el ISF muestreado desde el MN al ensayo inmunocromatográfico en papel mediante acción capilar, así como a evitar que el biosensor quede empapado por el exceso de ISF.

El biosensor inmunocromatográfico de nuevo diseño consta de una almohadilla de muestra, una almohadilla de liberación de conjugado, una membrana NC con una hoja de embalaje de tereftalato de polietileno (PET) transparente adherida a la parte posterior y una almohadilla de absorción. La almohadilla de muestra se ajustó a una membrana hidrófoba perforada y se interconectó con el sustrato de la matriz porosa de MN para la posterior recolección de muestras. En este caso, la proteína de pico RBD del SARS-CoV-2, que es el principal inmunógeno para inducir la producción de anticuerpos contra el COVID-1948, tiene una alta especificidad para unirse a los anticuerpos IgM/IgG anti-SARS-CoV-249. La proteína de pico RBD se conjugó con AuNP coloidales, se distribuyó en la almohadilla de conjugado pretratada y finalmente se unió a la parte superior de la almohadilla de muestra. A continuación, se colocó la tira de membrana NC sobre la almohadilla de conjugado. Se inmovilizaron anticuerpos anti-IgM e IgG humanos (monoclonales de ratón) en las líneas de prueba IgM e IgG de la membrana NC, respectivamente, para capturar los inmunocomplejos en los que el SARS-CoV-2 aumenta las AuNP conjugadas con RBD unidas con anti-SARS-CoV. -2 Anticuerpo IgM/IgG. Se prepararon AuNP conjugadas con IgG de conejo y se recubrieron sobre la misma almohadilla de conjugado para ser capturadas por un anticuerpo anti-IgG de conejo, que se inmovilizó en la membrana NC como línea de control. Se fijó una almohadilla de absorción al extremo distal de la tira de membrana NC para absorber el exceso de ISF y mantener el flujo continuo de muestra. El tamaño final del dispositivo de diagnóstico después del ensamblaje fue de 1,5 cm × 3,5 cm y el material y el tamaño de cada "papel" funcionalizado se muestran en la Tabla 1.

El principio del dispositivo de diagnóstico COVID-19 se muestra en la Fig. 1b. Después de penetrar la piel humana, la matriz porosa de MN extrae y transporta ISF a través de microporos continuos hasta el sustrato mediante acción capilar. Posteriormente, la almohadilla de muestra absorbe el ISF extraído y lo mueve verticalmente hasta la almohadilla de conjugado ubicada encima de la almohadilla de muestra. Si los anticuerpos IgM e IgG anti-SARS-CoV-2 están presentes en el ISF muestreado, se unirían a las AuNP marcadas con RBD de la proteína de pico del SARS-CoV-2 dispensadas en la almohadilla del conjugado. Los conjugados AuNP-anticuerpo migran verticalmente a la membrana NC. Debido a que la membrana NC mira hacia la almohadilla de conjugado, los conjugados continúan fluyendo lateralmente a través de toda la tira. Posteriormente, los anticuerpos IgM anti-SARS-CoV-2 son capturados por anticuerpos IgM anti-humano inmovilizados en la línea IgM, mientras que los anticuerpos IgG anti-SARS-CoV-2 son capturados por anticuerpos IgG anti-humano inmovilizados en la línea IgG. La presencia de anticuerpos IgM e IgG anti-SARS-CoV-2 se indica mediante líneas de colores, que se pueden leer a través de la hoja de embalaje de PET transparente. Si el ISF muestreado no contiene anticuerpos específicos contra el SARS-CoV-2, no se forman inmunocomplejos y, por lo tanto, no se observan etiquetas colorimétricas. El exceso de AuNP conjugadas con IgG de conejo es capturado por el anticuerpo anti-IgG de conejo inmovilizado en la línea de control. La aparición de una línea de control de color indica que el ISF muestreado migró a través del inmunoensayo y que el dispositivo funcionó de manera óptima. Finalmente, el líquido restante es recogido por la almohadilla de absorción mediante fuerza capilar, lo que proporciona un volumen de lecho suficiente para el flujo completo del ISF muestreado. Como se ilustra en la Fig. 1c, los resultados de la detección se pueden leer y obtener información crítica sobre el curso de la infección por COVID-19.

Varios estudios han explorado los métodos de fabricación para preparar MN porosos a partir de lixiviación de porógenos31,32,33,50. Sin embargo, el proceso de lixiviación lleva un tiempo relativamente largo y los materiales utilizados para la fabricación de MN son limitados porque se debe garantizar una resistencia mecánica suficiente, particularmente después de la eliminación de los porógenos. En este estudio, se ha propuesto un nuevo enfoque para fabricar directamente microestructuras porosas dentro de MN con gotas de emulsión. En este caso, se utilizó PLA, un polímero biodegradable producido a partir de recursos renovables51, para preparar microesferas. Se usaron microesferas de PLA preparadas con una sola emulsión para formar microporos interconectados directamente dentro de los MN (Fig. 2a), seguido de un tratamiento térmico para unirlos y estabilizar las estructuras porosas. El diámetro de las microesferas fabricadas fue de 15,5 ± 6,9 μm según lo determinado por microscopía óptica (Fig. 2b). Posteriormente, la solución preparada se vertió en el molde hembra de MN y se adquirieron MN porosos después de secarlos y pelarlos. Después del tratamiento térmico a cuatro temperaturas diferentes (170 °C, 180 °C, 190 °C y 200 °C), se midieron las formas y dimensiones del PLA MN poroso. Como se indica en la Fig. 2c, la forma de los MN se mantuvo después del tratamiento térmico (los MN después del tratamiento térmico a 170 ° C, 190 ° C y 200 ° C durante 30 min se muestran en la Fig. S1), mientras que una diferencia en el color de los MN porosos se observó antes y después del tratamiento térmico. Confirmamos que el cambio de color se atribuyó al PVA que se usó como surfactante al comparar los MN de PLA fabricados con los MN hechos solo con 5% (p/v) de PVA (Fig. S2a). Durante el tratamiento térmico, las fracciones de polieno formadas en las cadenas macromoleculares de PVA dieron como resultado un cambio gradual de la longitud de onda hacia una longitud de onda más larga52. Por lo tanto, en comparación con los MN antes del tratamiento térmico, el MN completo exhibió una coloración amarillo-marrón después del tratamiento térmico. Además, se supuso que el PVA desempeña dos funciones en la formación de PLA MN porosos a partir de los resultados del uso de diferentes soluciones de PVA (Fig. S2b). Uno es un tensioactivo en la formación de microesferas de PLA durante el proceso de emulsión única. El otro es mantener la forma de los MN durante el proceso de moldeo. Con respecto a las dimensiones de los MN fabricados, tanto la altura como el ancho de la base del MN disminuyeron ligeramente después del tratamiento térmico (Fig. 2d). Esta contracción podría atribuirse a la fusión y unión de las microesferas de PLA dentro de las estructuras MN.

Fabricación de PLA MN porosos con gotas de emulsión. (a) Se utilizó una emulsión única para fabricar microesferas de PLA seguida de un tratamiento térmico para fundir y unir microesferas para formar microporos interconectados. (b) Microesferas de PLA fabricadas obtenidas mediante microscopía óptica. (c) Matriz porosa de PLA MN antes (izquierda) y después del tratamiento (derecha) a 180 ° C durante 30 min. (d) Dimensiones de los MN de PLA porosos después del tratamiento térmico (n = 5).

La influencia de la temperatura utilizada para el tratamiento térmico en la formación de estructuras porosas dentro de los MN se investigó mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Las imágenes estructurales y transversales de un solo MN se muestran en la Fig. 3a. Después de que las microesferas de PLA se llenaron en la cavidad del molde MN y se secaron a 50 °C durante 2 h, se formaron huecos continuos entre las microesferas de PLA que no estaban unidas entre sí. Después del tratamiento térmico a 170 °C (punto de fusión del PLA) durante 30 minutos, una parte de las microesferas comenzó a fundirse y unirse entre sí. Cuando la temperatura se fijó en 180 °C, la mayoría de las microesferas se unieron, lo que dio lugar a la formación de poros interconectados del tamaño de una micra. Por el contrario, las microesferas se sobrefundieron y solo se confirmaron unos pocos huecos interconectados cuando los MN de PLA se calentaron a 200 °C. Estos resultados mostraron que la temperatura del tratamiento térmico influyó significativamente en la fusión y unión de las microesferas de PLA, así como en la formación de estructuras porosas.

Estructura porosa y absorción de fluidos de MN después del tratamiento térmico. (a) Imágenes SEM de una sola estructura MN y su sección transversal. (b) Porosidad de MN porosos determinada por el método de imbibición de agua. (c) El volumen absorbido de los fluidos de muestra del gel de agarosa al 1% (p/v) a 1 min y 2 min (n = 4).

A continuación, se midió la porosidad de los MN de PLA porosos utilizando el método de imbibición de agua (Fig. 3b). Antes del tratamiento térmico, la porosidad era de 27,2 ± 0,9%. A medida que aumentó la temperatura para el tratamiento térmico, la porosidad disminuyó gradualmente porque más microesferas de PLA se fundieron y unieron, lo que contribuyó a la disminución de los vacíos continuos dentro de los MN. Luego, se investigó la capacidad de absorción de los MN de PLA porosos fabricados después del tratamiento térmico. Se utilizó gel de agarosa (1%, p/v) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) cubierto con papel de aluminio para imitar la piel humana31. Se aplicó una fuerza de 5 N a la matriz MN para penetrar el modelo de piel. Después del tratamiento térmico a 170-200 °C, los MN perforaron con éxito el papel de aluminio y absorbieron la muestra de líquido del gel de agarosa. Sin embargo, los MN secados a 50 °C penetraron en el papel de aluminio pero no lograron mantener la estructura del MN, y la mayoría de las microesferas de PLA de los MN colapsaron y permanecieron dentro del gel de agarosa. Esto se atribuyó a la falta de adhesión entre las microesferas dentro de los MN. Los volúmenes de absorción de los fluidos de muestra durante 1 min y 2 min se muestran en la Fig. 3c. Los MN calentados a 180 °C tuvieron el mayor volumen de absorción de fluido de muestra en 2 minutos, lo que extrajo 109,8 ± 8,7 μL de fluido de muestra del modelo de piel humana. Dado que la piel humana tiene un menor contenido de agua entre 58 y 72%53 en comparación con el gel de agarosa al 1% que contiene una solución tampón al 99%, los MN porosos tratados térmicamente a 180 °C pueden extraer teóricamente de 64,4 a 79,8 μL de la piel humana en 2 mín. Suponiendo que el fluido extraído no puede infiltrarse en la membrana NC y fluir a través de la tira mediante acción capilar hasta que la almohadilla de muestra y la almohadilla de conjugado se saturen con el fluido extraído, teóricamente al menos 63,7 µL de ISF es la cantidad de absorción necesaria de la piel humana (calculada del tamaño total de la almohadilla de muestra y de la almohadilla de conjugado y la tasa de ingesta de la almohadilla de fibra de vidrio usada que es 50,9 μL/cm2). Por lo tanto, la matriz porosa de PLA MN sometida a un tratamiento térmico de 30 minutos a 180 °C podría extraer suficiente ISF para la posterior biodetección del inmunoensayo.

La resistencia mecánica de los MN de PLA porosos después del tratamiento térmico se midió y analizó realizando pruebas de compresión axial utilizando una estación de prueba de fuerza-desplazamiento (Fig. 4a). Como se demuestra en la Fig. 4b, antes del tratamiento térmico, la fuerza de falla promedio del PLA MN poroso seco fue de 0,13 ± 0,02 N, mientras que las fuerzas de falla promedio del PLA MN poroso después del tratamiento térmico a 170 °C, 180 °C, 190 ° C y 200 °C durante 30 min fueron 0,59 ± 0,08 N, 0,93 ± 0,11 N, 1,12 ± 0,14 N y 1,19 ± 0,13 N, respectivamente. Las curvas representativas de fuerza-desplazamiento de los MN porosos antes y después del tratamiento térmico se muestran en la Fig. S3. Los resultados indican que los MN de PLA porosos poseían suficiente resistencia mecánica (> 0,058 N) para la punción de la piel, independientemente de la temperatura a la que se realizó el tratamiento térmico54. Además, el módulo de Young (E) de los MN de PLA porosos podría calcularse en función de las dimensiones del MN y los resultados de las fuerzas de falla (ecuación (2)). El módulo de Young de los MN porosos aumentó notablemente de 120,7 ± 18,2 MPa antes del tratamiento térmico a 908,7 ± 26,4 MPa después del tratamiento térmico a 180 °C durante 30 min, y la resistencia mecánica de los MN porosos aumentó a una temperatura de calentamiento más alta debido a más microesferas de PLA. fusión y unión dentro de las estructuras MN (Fig. 4b).

Evaluación de propiedades mecánicas e inserción cutánea de MN porosos. (a) Un esquema de una configuración de prueba de compresión mecánica con sensor de fuerza de movimiento axial y micrografías ópticas de MN porosos tratados térmicamente a 180 °C antes y después de una prueba de falla axial. Barra de escala, 500 μm. (b) Fuerza de falla y módulo de Young calculado de MN porosos después del tratamiento térmico a diferentes temperaturas. (c) Eficiencia de penetración de PLA MN porosos después del tratamiento térmico a diferentes temperaturas. La imagen insertada muestra la inserción de MN porosos después del tratamiento térmico a 180 °C en la piel porcina teñida con azul de metileno. Barra de escala, 5 mm. (d) Inserción de piel de rata y extracción de ISF utilizando MN porosos unidos con un papel sensible a la glucosa y un papel en blanco. La piel dorsal de la rata se fijó en una plataforma impresa en 3D para la inserción de MN (d1) y las imágenes indicaron la extracción del ISF mediante MN porosos y su traslado a los papeles adjuntos en 5 minutos (d2), así como la recuperación de la piel de la rata con el tiempo después de la extracción de la matriz MN (d3). Barra de escala, 5 mm.

A continuación, se realizó una prueba de inserción con piel porcina para validar si los MN de PLA porosos eran lo suficientemente rígidos para perforar la piel. Los resultados mostraron que los MN porosos perforaron con éxito la piel porcina, independientemente del tratamiento térmico (Fig. S4). Sin embargo, aunque el parche MN sin tratamiento térmico se desprendió de la piel porcina después de la inserción, toda la estructura del parche MN no se mantuvo y finalmente se separó (Fig. S4a). Esto se debió a que las microesferas de PLA en todo el parche MN no se adhirieron entre sí, lo que provocó el colapso del parche durante la aplicación manual y su eventual separación cuando se despegó de la piel porcina. Por el contrario, la mayoría de los MN sometidos a un tratamiento térmico por encima de la temperatura de fusión perforaron con éxito la piel (Fig. S4b-d). Los resultados de la eficiencia de penetración (PE) de PLA MN porosos después del tratamiento térmico se muestran en la Fig. 4c. El PE de los MN porosos aumentó significativamente después del tratamiento térmico en comparación con el de los MN porosos antes del tratamiento térmico. Además, después del tratamiento térmico a 180-200 °C, los MN mostraron PE comparables, lo que indica que una adhesión suficiente de las microesferas de PLA fundidas calentadas a temperaturas superiores a 180 °C imparte a los MN una resistencia mecánica adecuada para perforar la piel y mantener su estructura después de la penetración.

Tras los resultados in vitro, realizamos una prueba in vivo en la que se aplicó una matriz de MN porosa tratada térmicamente a 180 °C a la piel dorsal de una rata viva con la fuerza del pulgar. Para verificar si los MN fabricados tienen capacidad de extracción, se unieron un biosensor de papel sensible a la glucosa31 y un papel en blanco a la matriz de MN porosa con cinta adhesiva transparente cubierta como se demuestra en la Fig. 4d1 y la Fig. S5. Después de la inserción de MN durante 5 minutos, los MN extrajeron el líquido corporal y lo infiltraron en el papel en blanco, así como en el biosensor de papel sensible a la glucosa (Fig. 4d2). Además, la reacción colorimétrica y el desarrollo del color azul del biosensor se observaron a simple vista debido a la oxidación de la 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina (TMB) empleada como tinte cromogénico (Fig. S5c), lo que indica el cuerpo. El líquido que contenía glucosa se extrajo y se transportó a través de MN a los papeles adjuntos por efecto capilar de las estructuras y papeles porosos de MN. Después de la extracción de los MN, también se examinó la recuperación de la piel después del tratamiento con MN. Como se muestra en la Fig. 4d3, los microagujeros correspondientes a los puntos de inserción de MN se marcaron en la superficie de la piel de la rata y se contrajeron gradualmente, lo que sugiere una rápida recuperación de la piel, así como una reducción del daño cutáneo después de la aplicación de MN. Posteriormente, la solución de luminol preparada se roció sobre el papel en blanco en la oscuridad para confirmar si había sangre en el fluido extraído (Fig. S5d2). Como resultado, no se visualizó ninguna reacción de quimioluminiscencia (Fig. S6), lo que sugiere que los MN fabricados podrían insertarse en la piel de la rata y extraer el ISF dérmico a la capa del sensor en 5 minutos.

Como se muestra en la Fig. 5a, b, se ensamblaron la matriz porosa de MN, la almohadilla de muestra preparada, la almohadilla de conjugado, la membrana NC, la almohadilla de absorción y la membrana hidrófoba perforada y se formó el PMNIA. La matriz porosa de MN se unió a un lado de la membrana hidrófoba usando una cinta de doble cara y el inmunoensayo preparado se fijó al otro lado. Luego, se aplicó cinta adhesiva transparente de una sola cara a ambos extremos de la membrana NC para fijar la estructura del inmunoensayo.

Montaje del PMNIA como parche de detección de anticuerpos anti-SARS-CoV-2, su capacidad de extracción de fluidos y tiempo completo de prueba de flujo. (a) Imagen del parche de detección ensamblado integrado con MN porosos y biosensor de inmunoensayo en papel. Barra de escala, 5 mm. (b) Componentes del conjunto PMNIA. (c) Ilustración del PMNIA aplicado en el modelo de piel e imágenes secuenciales de fotogramas fijos que demuestran la extracción de líquido de la muestra mediante MN porosos y su transporte a través de todo el biosensor de inmunoensayo, lo que lleva al desarrollo de un color púrpura rojizo en la línea de control. El tiempo de aplicación se indica en las esquinas superiores izquierdas. “c” en rojo representa la línea de control. Barra de escala, 5 mm.

A continuación, se probó el tiempo necesario para el flujo completo del parche de detección utilizando el modelo de piel humana. La matriz de MN se aplicó manualmente al modelo de piel y el líquido de muestra se extrajo y transportó mediante MN porosos. Poco después, la almohadilla conjugada fue humedecida por el líquido, que se transportó verticalmente hacia arriba desde la almohadilla de muestra por efecto capilar, y las AuNP marcadas se liberaron desde la almohadilla conjugada a la membrana NC (Fig. 5c). Los resultados indicaron que en 1 minuto, la matriz MN extrajo rápidamente el fluido de muestra y posteriormente fluyó hacia la almohadilla de muestra. Después de 3 minutos, el fluido de muestra fluyó a través de la tira de membrana NC y alcanzó la almohadilla de absorción. Además, el color púrpura rojizo de la línea de control indicó el punto donde las AuNP conjugadas con IgG de conejo pasaron a través de la zona de la línea de control y se unieron a la IgG anti-conejo. Por lo tanto, el tiempo total requerido para la extracción del fluido y su flujo completo a través de todo el parche de detección con confirmación visual del resultado fue de 3 minutos. Además, la almohadilla de absorción se empapó durante 8 minutos con la línea de control visualizada claramente.

El rendimiento del parche de detección de IgM/IgG anti-SARS-CoV-2 se evaluó mediante la realización de cuatro mediciones individuales. Simulante de ISF (tampón PBS) que contiene 0,5 µg/ml de anticuerpo IgM anti-SARS-CoV-2, 0,5 µg/ml de anticuerpo IgG anti-SARS-CoV-2, una mezcla de 0,5 µg/ml de IgM anti-SARS-CoV-2 y Se prepararon una solución de anticuerpo IgG y una solución de PBS como control y se pipetearon 80 µl de cada solución sobre la matriz MN porosa de los dispositivos de detección. Como se muestra en las figuras 6a1-a3, los resultados indicaron que si en la muestra había anticuerpos específicos del SARS-CoV-2, aparecería un color rojo/púrpura en la línea de prueba. Por el contrario, si los anticuerpos específicos del SARS-CoV-2 no estaban presentes en la muestra, no se unía ningún inmunocomplejo a las líneas de prueba; sin embargo, la línea de control estaba coloreada de rojo/púrpura, lo que indica que el fluido fluyó adecuadamente a lo largo del dispositivo, como se muestra en la Fig. 6a4. Además, cuando la muestra contenía solo anticuerpos IgM o IgG anti-SARS-CoV-2, las líneas IgM o IgG aparecían rojas/moradas, respectivamente, mientras que tanto las líneas IgM como IgG aparecían rojas/moradas cuando la mezcla de anti-SARS-CoV -2 Se aplicó solución de anticuerpos IgM e IgG. Las cuatro mediciones individuales se realizaron tres veces. Además, todos los resultados de las pruebas se pudieron observar en 3 minutos, lo que sugiere una detección rápida del anticuerpo IgM/IgG anti-SARS-CoV-2 utilizando este nuevo parche.

Detección de anticuerpos IgM/IgG específicos del SARS-CoV-2 mediante MN porosos integrados en parches e inmunoensayo en papel y su sensibilidad. (a) Resultados de la prueba visual de la muestra ISF que contiene IgM (a1), IgG (a2), una mezcla de IgM e IgG (a3) ​​y control en blanco (a4). Barra de escala, 5 mm. (b) Detección de IgM (b1) e IgG (b2) anti-SARS-CoV-2 con diferentes concentraciones. (c) La intensidad de color promedio de la línea IgM (c1) y la línea IgG (c2), y sus curvas ajustadas. Los gráficos se obtuvieron analizando tres parches de detección independientes (n = 3) para cada concentración objetivo y las curvas ajustadas corresponden a la siguiente ecuación: y = inicio + (final – inicio) × xn/(kn + xn). Para detección de IgM (c1): inicio = 8,29 ± 0,29, final = 63,24 ± 3,12, k = 1801,30 ± 732,86, n = 0,76 ± 0,09 con R2 = 0,998; Para detección de IgG (c2): inicio = 2,54 ± 0,43, final = 157,29 ± 33,49, k = 1322,64 ± 534,49, n = 1,12 ± 0,11 con R2 = 0,993.

A continuación, se investigó la sensibilidad del nuevo inmunoensayo utilizando diluciones seriadas de muestras de anticuerpos IgM e IgG anti-SARS-CoV-2 para la detección. Las soluciones de muestra que contenían anticuerpos IgM e IgG se prepararon en el rango de 0,1 a 10 µg/ml y luego se utilizaron 80 µL de cada solución de muestra para el análisis. La Figura 6b1 muestra la imagen del dispositivo de detección de COVID-19 que prueba diferentes concentraciones de anticuerpo IgM anti-SARS-CoV-2 (0,1–10 µg/ml). Los resultados demostraron que a medida que disminuía la concentración de IgM, el color púrpura rojizo en la línea de IgM se debilitaba a medida que se formaban y atrapaban menos inmunocomplejos RBD-AuNPs-IgM de picos de SARS-CoV-2 en las líneas de IgM. Los resultados de las pruebas de diferentes concentraciones de anticuerpo IgG anti-SARS-CoV-2 (0,1 a 10 µg/ml) se muestran en la Fig. 6b2. Esto también indicó que la intensidad del color se correlacionaba positivamente con la concentración de IgG.

Luego, se calculó el LoD para el anticuerpo IgM/IgG anti-SARS-CoV-2 después de probar diferentes concentraciones (10–0,1 ng/ml) y las curvas sigmoidales se muestran en las figuras 6c1,c2. El LoD para los anticuerpos IgM e IgG fue de 3 ng/mL y 7 ng/mL, respectivamente, calculado utilizando el método estándar de la IUPAC (LoD = valor medio del control en blanco + tres veces la desviación estándar del control en blanco)55. Los resultados sugieren que el nuevo parche desarrollado tenía una alta sensibilidad a los anticuerpos IgM/IgG contra el SARS-CoV-2, comparable o superior a la de las tiras LFIA comerciales56,57.

Los métodos de detección actuales de COVID-19, como la RT-PCR, requieren costosas instalaciones de laboratorio, técnicos de laboratorio capacitados y tiempos de respuesta prolongados, lo que dificulta la detección masiva y la identificación de personas infectadas en países en desarrollo con recursos limitados. Otro método es probar IgM/IgG específica del SARS-CoV-2 utilizando LFIA como herramienta complementaria para esperar una infección reciente o previa, así como confirmar casos sospechosos de COVID-19 con resultados negativos de RT-PCR. Sin embargo, la extracción de una muestra de sangre causa dolor a los examinados y puede provocar una infección en el lugar de la perforación. Para abordar estos desafíos, desarrollamos un nuevo método tipo parche para la detección de COVID-19 mediante la integración de MN porosos y un nuevo ensayo inmunocromatográfico. El dispositivo propuesto facilita la detección rápida y mínimamente invasiva de anticuerpos IgM/IgG específicos del SARS-CoV-2 mediante la toma de muestras de ISF en lugar de sangre. Además, el parche de detección de COVID-19 puede ser autoaplicado sin asistencia de personal médico.

Actualmente, el trabajo existente sobre MN para la extracción de ISF y la posterior biodetección se centra principalmente en MN huecos o hinchables. Sin embargo, los MN huecos suelen estar hechos de metal o polímeros no biodegradables que pueden dañar la salud humana, y los MN hinchables requieren un proceso laborioso para recuperar los analitos extraídos42. Por el contrario, aunque los MN porosos pueden resolver estos problemas, plantean desafíos debido a procesos de fabricación complicados y que requieren mucho tiempo. Por lo tanto, proponemos un proceso de fabricación novedoso y simple para MN porosos compuestos de microesferas de PLA biodegradables. Los microporos interconectados se formaron directamente por los huecos entre las microesferas de PLA que posteriormente fueron tratadas térmicamente. El tratamiento térmico hizo que las microesferas se derritieran y se unieran, dando como resultado estructuras porosas estables y robustas. La ventaja del método de fabricación propuesto es que una vez que se forman las microesferas de PLA, la forma esférica se puede mantener de manera estable en un ambiente ambiental; además, son susceptibles de producción a mayor escala. La temperatura óptima para el tratamiento térmico fue de 180 °C, y el volumen de absorción del fluido de la muestra (110 µL/matriz en 2 min) sugirió una capacidad de absorción suficiente para la biodetección.

Además, aprovechando la extracción de ISF en dirección vertical mediante acción capilar, diseñamos y desarrollamos un inmunoensayo en papel en una nueva estructura que incorpora estructuras de flujo vertical y lateral para adaptarse a matrices de MN porosas y permitir la visualización de resultados inmunocromatográficos. Además, la longitud de la membrana NC fue de 2 cm para acortar la distancia del flujo ISF y el tiempo de detección fue de 3 min. En comparación, los LFIA comerciales para pruebas de anticuerpos IgM/IgG requieren muestreo de sangre, dispensación de tampón y un tiempo de espera de 15 minutos. Por lo tanto, nuestro parche de detección es compacto, fácil de usar y proporciona resultados confiables en un tiempo comparativamente más corto.

Además, la sensibilidad (LoD) de PMNIA fue de 3 ng/mL para la detección de IgM y de 7 ng/mL para la detección de IgG, que es mejor que la de algunos de los kits LFIA comerciales actuales basados ​​en AuNP que detectan virus específicos del SARS-CoV-2. anticuerpos58. Por lo tanto, el PMNIA desarrollado proporcionó una detección más precisa de anticuerpos IgM/IgG específicos del SARS-CoV-2 y redujo la tasa de falsos negativos. Aunque los anticuerpos específicos del SARS-CoV-2 en el ISF dérmico no se han estudiado ampliamente, estudios previos sobre el análisis proteómico de fluidos corporales han informado que, en comparación con el plasma y el suero, el ISF es altamente homogéneo e idéntico en términos de diversidad de proteínas, incluidas las inmunoglobulinas59. 60. Por lo tanto, esperamos que los niveles de anticuerpos IgM/IgG anti-SARS-CoV-2 en el ISF se correlacionen bien con los de la sangre y puedan detectarse mediante el PMNIA propuesto. En el futuro, la validación clínica del sensor de parche desarrollado se llevará a cabo en personas infectadas y no infectadas que no hayan sido vacunadas para investigar la especificidad y sensibilidad en comparación con la RT-PCR como estándar de oro para el diagnóstico clínico de COVID-1920. Además, se llevará a cabo la comparación del rendimiento de detección del nuevo dispositivo con los LFA disponibles comercialmente utilizando muestras de sangre y muestras de ISF. Se prevé que el parche de detección mínimamente invasivo, simple y rápido muestre grandes perspectivas para la detección de biomarcadores de proteínas en la FIS y el diagnóstico de otras enfermedades infecciosas, y pueda emplearse ampliamente en entornos con recursos médicos limitados.

En este estudio, se desarrolló un nuevo dispositivo de diagnóstico de COVID-19 tipo parche, PMNIA, que integra MN porosos y un biosensor inmunocromatográfico. Se optimizó un método de fabricación simple y novedoso para MN de PLA poroso biodegradable mediante emulsión y tratamiento térmico para lograr la mejor capacidad de absorción y suficiente resistencia mecánica para perforar la piel dorsal de porcinos y ratas. La estructura del inmunoensayo en papel se diseñó con flujo vertical y lateral para realizar un muestreo continuo desde la matriz MN hasta el biosensor del inmunoensayo y permitir una visualización clara de los resultados de la detección a simple vista. Se realizó una prueba in vitro utilizando un modelo de piel aplicando el parche a gel de agarosa y los resultados se observaron en la línea de control en 3 minutos. Además, el LoD para la detección de anticuerpos específicos del SARS-CoV-2 indicó una alta sensibilidad en comparación con la de los LFIA comerciales. Imaginamos que las personas puedan detectar anticuerpos IgM e IgG contra el SARS-CoV-2 de forma rápida y sin dolor utilizando este inmunoensayo recientemente estructurado. Además, el tamaño compacto del dispositivo de diagnóstico integrado resulta ventajoso tanto para los médicos como para los pacientes. Además, el dispositivo propuesto tiene un gran potencial para la detección rápida de diversos tipos de enfermedades infecciosas como método complementario eficaz con otras pruebas de diagnóstico.

Para la fabricación y evaluación de los MN de PLA porosos, se obtuvo PLA (Ingeo 4032D) de NatureWorks (Minneapolis, MN, EE. UU.). Se adquirieron diclorometano (135-02446), trehalosa dihidrato (202-18452), luminol (123-02583) y peróxido de hidrógeno (081-04215) de Fujifilm Wako Pure Chemical (Osaka, Japón). Se obtuvieron poli(alcohol vinílico) (363103), azul de metileno (M9140), peroxidasa de rábano picante (SRE0082), 3,3′,5,5′-tetrametilbencidina (860336), glucosa oxidasa (G7141) y carbonato de sodio (V800370). de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.). El prepolímero de polidimetilsiloxano (PDMS) y el agente de curado (Silpot 184) se adquirieron de Dow Chemical Company (Midland, MI, EE. UU.). El gel de agarosa (NE-AG01) se adquirió de Nippon Genetics (Tokio, Japón). El isoflurano se obtuvo de Pfizer (Nueva York, NY, EE. UU.). La crema depilatoria (LBS-s, Veet) se compró en Reckitt Japan (Tokio, Japón).

Para la preparación del inmunoensayo en papel, la almohadilla de muestra, la almohadilla de conjugado (Estándar 14), la membrana NC (FF120 HP Plus) y la almohadilla de absorción (CF4) se adquirieron de Whatman (Maidstone, Reino Unido). Las membranas hidrófobas se obtuvieron de LINTEC Co. (Tokio, Japón). Se compraron coloides de oro (AuH2, 40 nm) de Morinaga (Yokohama, Japón). El tampón borato se obtuvo de Fujifilm Wako Pure Chemical. Proteína de pico de SARS-CoV-2 RBD (C19SD-G241H), anticuerpo de proteína hIgM de pico anti-SARS-CoV-2 (G19S1-M60H), anticuerpo de proteína hIgG de pico anti-SARS-CoV-2 (G19S1-60H), anti -El anticuerpo monoclonal IgM humano (H38M-60M-1000) y el anticuerpo monoclonal IgG antihumano de ratón (H38-60M-1000) se adquirieron de SignalChem (Richmond, Canadá). El anticuerpo IgG de conejo (I8140), la albúmina sérica bovina (BSA, A7030) y el monolaurato de polioxietileno (20) sorbitán (Polisorbato 20 o Tween-20, P1379) se adquirieron de Sigma-Aldrich, y la IgG anti-conejo (H + L) El anticuerpo se obtuvo de Funakoshi (Tokio, Japón). PBS se obtuvo de Nacalai Tesque (Kyoto, Japón).

El molde macho de acero inoxidable MN se diseñó y fabricó por primera vez mediante mecanizado por descarga eléctrica con alambre. La matriz de MN se diseñó en una matriz de 13 × 13 con una distancia de punta de MN de 1 mm, y cada MN se diseñó en forma piramidal (1200 µm de altura) y una base cuadrada (620 µm de ancho). Se vertió una mezcla de PDMS y agente de curado (10:1, p/p) sobre el molde macho MN, seguido de desgasificación y curado en un horno a 80 °C durante 1 h. Luego, el molde hembra PDMS de los MN se separó del molde de acero inoxidable y posteriormente se utilizó para fabricar MN de PLA poroso.

Primero, se preparó PLA al 6,7 % (p/v) en 15 ml de diclorometano como fase orgánica y se mezcló con la fase acuosa que contenía alcohol polivinílico (PVA) al 5 % (p/v) como tensioactivo en agua desionizada (DI). Para obtener microesferas de PLA, la mezcla se agitó a 1000 rpm a 25 °C durante 6 h hasta que el diclorometano se evaporó por completo.

Luego se vertió la solución de microesferas de PLA fabricada en el molde hembra de PDMS preparado. Después de aspirar para llenar las microesferas en las cavidades, todo el molde se colocó en un horno de convección a 50 °C durante 2 h para evaporar la solución y secar la solución de microesferas de PLA para formar la estructura MN. Luego se despegó la matriz MN del molde. Luego, se aplicó un tratamiento térmico a una temperatura superior al punto de fusión del PLA (170 °C) durante 30 minutos para hacer que las microesferas se fundieran y se unieran. Después del secado y tratamiento térmico a cuatro temperaturas diferentes (170 °C, 180 °C, 190 °C y 200 °C).

La porosidad de los MN de PLA porosos se midió utilizando el método de imbibición de agua y películas de PLA porosas comparando sus masas antes y después de la extracción de fluidos. Primero, se registró la masa seca (Wdry), después de lo cual la película preparada se sumergió en agua desionizada; El agua superficial se eliminó después de que se permitió la absorción hasta la saturación. Posteriormente, la masa se midió inmediatamente y se registró como Wwet. La porosidad se calculó utilizando la siguiente ecuación:

donde ρp es la densidad del PLA (1,25 g/cm3) y ρ0 es la densidad del agua DI (1,0 g/cm3).

La fuerza de falla de los MN porosos después del tratamiento térmico a diferentes temperaturas se evaluó realizando pruebas de compresión axial utilizando equipos comerciales de fuerza-desplazamiento (MX2-500N; Imada Inc., Toyohashi, Japón). Se colocó un único MN poroso sobre una placa plana y se comprimió mediante una superficie metálica rígida a una velocidad de 2 mm/min. La fuerza de compresión y el desplazamiento se midieron continuamente hasta que el MN se rompió, y la fuerza de falla por pandeo se registró cuando la fuerza cayó repentinamente al fallar la aguja.

De acuerdo con las dimensiones de los MN y los resultados experimentales de las fuerzas de falla, el módulo de Young (E) de los MN de PLA porosos se calculó con base en la siguiente ecuación61,62:

donde L representa la altura del MN piramidal y P es la carga crítica de pandeo que también se refiere a la fuerza de falla del MN54. W1 y W2 representan el ancho del diámetro de la punta y la base MN, respectivamente. Esta ecuación tiene una condición límite en la que la base MN está fija y la punta MN puede moverse libremente. La matriz MN porosa fabricada satisfizo el caso sin arreglos.

Para evaluar la capacidad de inserción en la piel de los MN de PLA porosos, se utilizó piel de cadáver porcino (K1270; Funakoshi, Tokio, Japón) para imitar la piel humana debido a sus similitudes anatómicas y fisiológicas63. Se insertaron MN porosos en piel porcina durante 1 min bajo presión con el dedo (~ 30 N) y luego se retiraron de la piel. Posteriormente, la superficie de la piel se tiñó con azul de metileno al 1% (p/v) durante 15 minutos y luego se limpió con etanol. Los sitios penetrados por MN se identificaron mediante estereomicroscopía (Stereozoom S9D; Leica, Wetzlar, Alemania). A partir de la observación de las manchas, se calculó el PE mediante la siguiente ecuación:

El papel en blanco circular se preparó a partir de un papel de filtro (Grado 4; Whatman, Maidstone, Reino Unido) con un diámetro de 5 mm. El papel circular sensible a la glucosa (Grado 4) se preparó con glucosa oxidasa y peroxidasa de rábano picante como enzimas y TMB como colorante cromogénico que se han utilizado comúnmente como ensayos colorimétricos para la detección del nivel de glucosa31,64. En primer lugar, se preparó el agente enzimático mezclando 100 U/ml de GOX (145,2 U/mg) y 100 U/ml de HRP (279 U/mg) en 1 ml de tampón PBS con trehalosa 250 mM como estabilizador. Luego, se pipetearon 4 µL de la solución preparada sobre el papel y se secaron a 25 °C. A continuación, se preparó el agente cromogénico disolviendo TMB 15 mM en 1 ml de metanol y se pipetearon con 4 µl sobre el mismo papel de filtro y se secó a 25 °C. La preparación del biosensor de papel sensible a la glucosa y el papel en blanco se completaron y se fijaron a la matriz MN con cinta adhesiva transparente cubierta como se ilustra en la Fig. S5a.

La solución de luminol se ha empleado ampliamente para verificar la presencia de sangre mediante una reacción quimioluminiscente65. La solución se preparó disolviendo 0,1 g de luminol, 5 g de carbonato de sodio anhidro y 15 ml de solución de peróxido de hidrógeno al 30 % en 100 ml de agua desionizada y se almacenó en la oscuridad.

Se utilizaron ratas Sprague-Dawley (CLEA, Tokio, Japón) a la edad de diez semanas para caracterizar la recuperación de la piel después del tratamiento con MN. Primero, la rata se colocó y se anestesió en la cámara de inducción precargada con isoflurano al 5% a un caudal de 2,5 l/min utilizando un aparato anestésico inhalado para roedores (WP-SAA01; LMS, Tokio, Japón). Después de la inducción de la anestesia por inhalación, la rata fue trasladada a una placa calefactora para mantener su temperatura corporal. Luego se cubrió la rata con una máscara nasal y se aplicó isoflurano al 2% a un caudal de 2,5 l/min desde un inhalador durante la depilación y la prueba de penetración de MN. El pelo de la piel dorsal de la rata (2 cm x 2 cm) se afeitó con una afeitadora eléctrica y posteriormente se aplicó 0,5 g de crema depilatoria durante 1 minuto, lo que dio como resultado la piel de la rata expuesta después de retirar la crema depilatoria con pañuelos húmedos. Para evitar daños físicos a la rata cuando se aplica una fuerza continua para la inserción de MN, la piel dorsal de la rata se fijó en una plataforma de PLA impresa en 3D (Fig. 4d1). La matriz de MN porosa unida con papeles preparados se colocó sobre la piel dorsal y se aplicó con una fuerza con el pulgar (~ 30 N) durante 5 minutos y luego se despegó para una observación adicional. La solución de luminol preparada se roció sobre el papel en blanco para confirmar si había sangre presente en el fluido extraído. La prueba con animales fue aprobada por el comité de ética de la investigación del Instituto de Ciencias Industriales de la Universidad de Tokio (el número de aprobación ética: 03-05 en 2021) y este estudio se realizó de acuerdo con las pautas de ARRIVE.

Para preparar las AuNP conjugadas con RBD de la proteína de pico del SARS-CoV-2, se agregaron 10 µg de RBD de la proteína de pico del SARS-CoV-2 recombinante a una mezcla de 1 ml de coloide de AuNP (40 nm de diámetro, DO = 12) y 0,1 ml de borato. tampón (0,1 M, pH 8,5) para facilitar la unión de proteínas a la superficie de las AuNP. Después de una incubación de 30 minutos a 25 °C, se agregaron 100 µl de BSA (10 mg/ml) para bloquear la superficie de AuNP. Después de 15 minutos de incubación a 25 °C, las muestras se centrifugaron a 8600 g durante 20 minutos a 4 °C. Luego, se descartó el sobrenadante y se añadió 1 ml de BSA (1 mg/ml) para resuspender las AuNP conjugadas; su superficie se bloqueó nuevamente y se eliminó la proteína de pico no unida. Los pasos de centrifugación y resuspensión se repitieron dos veces y se usó 1 ml de PBS para la resuspensión final. Las AuNP conjugadas con IgG de conejo se prepararon utilizando el mismo procedimiento.

La almohadilla de muestra se preparó cortándola en un tamaño de 1 cm x 1 cm y posteriormente sumergiéndola en la solución de pretratamiento que contenía BSA al 0,5 % (p/v) y Tween-20 al 0,05 % (v/v) en PBS hasta que estuviera completamente húmeda. Luego, la almohadilla de muestra se secó a 37 °C durante 2 h en un horno.

La almohadilla de conjugado se cortó en un tamaño de 5 mm x 5 mm, se pretrató con un tampón que comprendía sacarosa al 5% (p/v), BSA al 1% (p/v) y Tween-20 al 0,1% (v/v). Se secó a 37°C durante 2 h. En este caso, se utilizó sacarosa para preservar la estabilidad de la proteína después de la deshidratación y mejorar la rápida resolubilización tras la humectación66. Luego, la almohadilla conjugada se recubrió sucesivamente con las AuNP conjugadas con RBD de la proteína de pico SAR-CoV-2 preparadas y las AuNP conjugadas con IgG de conejo y luego se secó a 37 °C.

El anticuerpo de captura anti-IgM humana, el anticuerpo anti-IgG humana y el anticuerpo anti-IgG de conejo se inmovilizaron en la membrana NC (4 mm × 2 cm) utilizando un hisopo de poliéster con una punta afilada (200-CD055; Sanwa Direct, Okayama, Japón) como las líneas de prueba de IgM, prueba de IgG y control, respectivamente. La línea de IgM se imprimió a 7 mm de un extremo de la membrana NC y la distancia entre las dos líneas fue de 4 mm. Posteriormente, la membrana NC se bloqueó con BSA al 2% (p/v) en PBS, seguido de lavado con Tween-20 al 0,05% (v/v) en PBS, y luego se secó a 37 °C durante 30 min. Se colocó la almohadilla de adsorción, sin ningún tratamiento, superpuesta entre 1 y 2 mm con la membrana NC.

Después de que la señal colorimétrica en las líneas de prueba y control se estabilizara, los parches de detección se colocaron en una caja y se tomaron fotografías con una cámara (D5500; Nikon, Tokio, Japón). Las condiciones de configuración, incluidos los parámetros de la cámara, la fuente de luz y la distancia entre el parche de detección y la cámara, se fijaron y se mantuvieron constantes durante la toma de imágenes. A continuación, la imagen se importó a ImageJ (Instituto Nacional de Salud, Bethesda, MD, EE. UU.) y se seleccionó el canal verde porque proporciona la mayor sensibilidad para el análisis de etiquetas rojas, como las AuNP66. Se trazó una línea recta a lo largo de la membrana NC. El ancho de la línea recta se ajustó para cubrir la mayor parte de la tira para aumentar la reproducibilidad. Luego, se midió la intensidad máxima de las líneas de prueba (IgM o IgG) después de probar diferentes concentraciones restando el valor de intensidad máxima del valor de intensidad de fondo. Posteriormente, los datos se importaron al software Origin (2021b; OriginLab, Northampton, MA, EE. UU.) y se obtuvo el mejor ajuste de datos utilizando una curva logística de cuatro parámetros para el análisis estadístico, incluida la determinación del LoD para IgM/IgG. Todos los métodos, incluidos los experimentos con animales, se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes (las directrices ARRIVE 2.0) y, como se mencionó anteriormente, todas las pruebas con animales fueron aprobadas por el comité de ética de la investigación del Instituto de Ciencias Industriales de la Universidad de Tokio, Japón.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado (y sus archivos de información complementarios).

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Descargar referencias

Este trabajo fue apoyado por el Programa Core-to-Core A (JETMeE) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS). Los autores agradecen al Prof. Kai Chieko, al Prof. Yoneda Misako y al Dr. Soojin Shim por sus consejos sobre el desarrollo de biosensores por inmunoensayo y a la Sra. Kinoshita por su ayuda con los experimentos con animales. La caricatura de la rata en la Fig. S5a de Información complementaria se creó con BioRender.com.

Esta investigación fue apoyada por el programa Core-to-Core A de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) (subvención n.° JPJSCCA20190006), Japón.

Instituto de Ciencias Industriales, Universidad de Tokio, 4-6-1 Komaba, Meguro-ku, Tokio, 153-8505, Japón

Leilei Bao, Parque Jongho, Boyu Qin y Beomjoon Kim

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BK inició el proyecto. LB desarrolló la metodología de fabricación y diseñó y caracterizó el dispositivo. LB, JP y BQ realizaron los experimentos y analizaron los datos. LB escribió el artículo original. JP, BQ y BK revisaron y comentaron el manuscrito. Todos los autores revisaron críticamente el trabajo y aprobaron la versión final.

Correspondencia a Beomjoon Kim.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Bao, L., Park, J., Qin, B. et al. Detección de anticuerpos IgM/IgG anti-SARS-CoV-2 mediante un sensor de parche que contiene microagujas porosas y un inmunoensayo en papel. Informe científico 12, 10693 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-14725-6

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Recibido: 16 de marzo de 2022

Aceptado: 10 de junio de 2022

Publicado: 01 de julio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-14725-6

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