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Una nueva variante de empalme de Elp3/Kat9 regula la modificación y función del ARNt mitocondrial

Oct 23, 2023

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 14804 (2022) Citar este artículo

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Las modificaciones postraduccionales, como la acetilación de la lisina, regulan la actividad de diversas proteínas en muchos compartimentos celulares. La desacetilación de proteínas en las mitocondrias está catalizada por la actividad enzimática de la desacetilasa sirtuina 3 dependiente de NAD+ (SIRT3); sin embargo, no está claro si existen las correspondientes acetiltransferasas mitocondriales. Utilizamos un enfoque bioinformático para buscar proteínas mitocondriales con un dominio catalítico de acetiltransferasa e identificamos una nueva variante de empalme de ELP3 (mt-ELP3) del complejo elongador, que se localiza en la matriz mitocondrial en células de mamíferos. Inesperadamente, mt-ELP3 no media la acetilación de proteínas mitocondriales, sino que induce una modificación postranscripcional de los ARN de transferencia mitocondriales (mt-tRNA). La sobreexpresión de mt-ELP3 conduce a la protección de los mt-tRNA contra la RNasa angiogenina específica de tRNA, aumenta la traducción mitocondrial y, además, aumenta la expresión de los complejos OXPHOS. Por lo tanto, este estudio identifica mt-ELP3 como una enzima modificadora de mt-tRNA no canónica.

La acetilación de lisina es un regulador destacado de múltiples proteínas que residen en diferentes compartimentos celulares, incluidas las enzimas metabólicas mitocondriales1. Esta modificación postraduccional reversible está controlada por lisina acetiltransferasas (KAT) y desacetilasas (KDAC) competitivas que catalizan la adición y eliminación, respectivamente, de un grupo acetilo de un residuo de lisina2. Anteriormente demostramos que SIRT3 es una proteína desacetilasa mitocondrial dependiente de NAD+ que controla el metabolismo energético3. Estos hallazgos nos motivaron a buscar cualquier KAT mitocondrial correspondiente. Dado que la matriz mitocondrial tiene una mayor concentración de acetil-CoA y un pH más alto que otros compartimentos celulares, se ha propuesto que la acetilación mitocondrial se produzca mediante un mecanismo no enzimático1. Sin embargo, este mecanismo no excluye la existencia de un KAT mitocondrial. De hecho, GCN5L1 (control general de la síntesis de aminoácidos 5) similar a 1 y ACAT1 (acetil-CoA acetiltransferasa 1) son KAT mitocondriales plausibles4,5.

Aquí, hemos utilizado un enfoque bioinformático para buscar proteínas mitocondriales con un dominio catalítico de acetiltransferasa. Este análisis condujo a la identificación de una nueva variante de empalme de la proteína elongadora 3 (ELP3), también conocida como KAT9, la subunidad catalítica conocida del complejo elongador de la transcripción de seis subunidades (Elp1-Elp6). ELP3 tiene dos supuestos dominios enzimáticos: el dominio radical S-adenosilmetionina (SAM) contiene hierro-azufre [4Fe-4S], un grupo importante para la metilación de ARNt mediante actividad reductora de escisión de SAM6,7,8,9 y un C-terminal Dominio KAT con similitud de secuencia con la superfamilia de acetiltransferasas similares a GCN5. Por lo tanto, ELP3 podría acetilar histonas10 y otras proteínas dianas, utilizando acetil-CoA como cofactor11. Sin embargo, ELP3 también puede modificar los ARNt citoplasmáticos (cyt)12,13. A este respecto, se requiere ELP3 para formar la modificación 5-metoxi-carbonilmetil-2-tiouridina (mcm5s2U34) y 5-carbamoil-metil-2-tiouridina (ncm5s2U34) de las uridinas oscilantes U34 (posición 34) en muchos cyt-tRNA. objetivos12,13,14. Estas modificaciones postranscripcionales del ARNt son necesarias para la precisión y eficiencia de la traducción de proteínas15,16, y la falta de ellas conduce a una variedad de enfermedades humanas17,18. En particular, la desregulación de la actividad de modificación del ARNt de ELP3 se asocia principalmente con trastornos neurológicos19,20.

En el presente estudio, caracterizamos esta nueva variante de empalme de ELP3 (mt-ELP3) y proporcionamos evidencia de que mt-ELP3, pero no otras variantes, se localiza en las mitocondrias. Inesperadamente, mt-ELP3 no participa en la acetilación de proteínas mitocondriales, sino en la modificación postranscripcional de los ARNt mitocondriales (mt). Mostramos que la sobreexpresión de mt-ELP3 conduce a la protección de los mt-tRNA contra la RNasa angiogenina específica de tRNA y mejora la función mitocondrial al aumentar la traducción mitocondrial, la expresión de los complejos del sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) y la respiración mitocondrial. En particular, mt-ELP3 se expresa altamente en el cerebro, lo que sugiere que puede desempeñar un papel importante en este tejido. En general, nuestros hallazgos identifican a mt-ELP3 como una enzima modificadora de mt-tRNA no canónica.

Para identificar nuevos KAT mitocondriales, buscamos productos de empalme KAT, NAT (N-acetiltransferasa) y NAA (N-alfa acetiltransferasa) en Amigo (http://amigo.geneontology.org/amigopaap), Panther (http:/ /www.pantherdb.orgke) y bases de datos de vías de Kegg (https://www.genome.jp/kegg/pathway.html) y21. Este análisis condujo a la identificación de 55 genes que codifican un supuesto dominio de acetiltransferasa en el genoma humano. Utilizando la base de datos Ensemble, extrajimos 276 isoformas empalmadas para todos los candidatos y realizamos un análisis de orientación mitocondrial in silico utilizando TargetP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TargetP-2.0), Predotar (http:/ /urgi.versailles.inra.fr/predotar/predotar.html) y las bases de datos Wolfpsort (https://wolfpsort.hgc.jp). Cada isoforma empalmada se calificó arbitrariamente (la estrategia se ilustra en la Fig. S1). Las 20 principales isoformas KAT mitocondriales potenciales incluyen 3 variantes de empalme de ELP3 (Tabla complementaria 1 y Fig. S2): isoforma empalmada ELP3/Kat9 203 (ENSP00000439242), isoforma empalmada ELP3/Kat9 202 (ENSP00000445558) y ELP3/Kat9 003 s isoforma cortada ( ENSP00000429180). En particular, las isoformas empalmadas 202 y 203 tienen el mismo codón de inicio (Fig. S2), por lo tanto, consideramos las isoformas empalmadas 203 y 003 para estudios posteriores. Los estudios posteriores se centraron en la localización mitocondrial de estas isoformas y su función en las mitocondrias.

ELP3 se localiza predominantemente en el citoplasma22,23,24, pero también puede localizarse en las mitocondrias25,26. Para determinar la localización subcelular de ELP3, el ELP3 canónico (ELP3-ORF1), la isoforma empalmada 003 (ELP3-ORF2) y la isoforma empalmada 203 (ELP3-ORF3) (Figs. S2 y S3) se marcaron en el extremo C-terminal con un epítopo FLAG. en el vector pcDNA T0 y se expresa transitoriamente en células HeLa usando pcDNA T0. El análisis de inmunofluorescencia mostró que solo ELP3-ORF3 etiquetado con FLAG se co-localizó con el marcador mitocondrial, cox IV (Fig. 1A), lo que confirma que solo esta isoforma (en lo sucesivo, mt-ELP3) se localiza en las mitocondrias. Para investigar la localización submitocondrial de mt-ELP3, utilizamos un ensayo de sensibilidad a la proteinasa K. Se utilizó un sistema de expresión regulado por tetraciclina para la expresión inducible de la proteína mt-ELP3 en células HEK293T, y las mitocondrias aisladas de estas células (Fig. 1B) se trataron con concentraciones crecientes de digitonina (detergente suave) en presencia de proteinasa K. Mt- ELP3 fue protegido de la escisión por la proteinasa K, excepto en altas concentraciones de digitonina, que disuelve las membranas mitocondriales (Fig. 1C). Esta sensibilidad fue similar a la de la proteína de matriz HSP60 (Fig. 1C). Por el contrario, TOM20, una proteína de la membrana externa mitocondrial, era sensible a la proteinasa K incluso en ausencia de digitonina (Fig. 1C). Estos hallazgos indican que mt-ELP3 es una proteína de la matriz mitocondrial.

La isoforma ELP3-203 es una proteína de la matriz mitocondrial. (A) Localización subcelular de ELP3 en mitocondrias. Las líneas celulares HeLa se transfectaron transitoriamente con plásmidos pcDNA ELP3-ORF1, pcDNA ELP3-ORF2 y pcDNA ELP3-ORF3. La distribución intracelular de las proteínas ELP3-ORF1, ELP3-ORF2 y ELP3-ORF3 se reveló con un anticuerpo primario monoclonal contra Flag y Alexa Fluor-488 (fluorescencia verde). La expresión de COXIV (marcador mitocondrial) en las mismas células se evaluó con un anticuerpo monoclonal contra COXIV y Alexa Fluor 594 (fluorescencia roja). Los paneles de la derecha muestran imágenes fusionadas para el tinte COXIV y las proteínas ELP3-ORF1, ELP3-ORF2 y ELP3-ORF3 expresadas endógenamente en células HeLa. El color amarillo muestra la colocalización de COXIV con ELP3-ORF1, ELP3-ORF2 y ELP3-ORF3. Los núcleos (azul) se visualizaron con DAPI. Estas imágenes son representativas de tres experimentos separados. El histograma adjunto muestra un análisis cuantitativo de ELP3-ORF1, ELP3-ORF2 y ELP3-ORF3 co-localizados con el marcador COXIV en células HeLa mediante el coeficiente de correlación de Pearson. Todos los datos son media ± DE de al menos tres experimentos. ***p < 0,001. ns: no significativo. (B) Análisis de transferencia Western de la proteína mt-ELP3 en la fracción mitocondrial de células T-REx-293 tratadas (+Tet) o no (-Tet) con tetraciclina. Se utilizaron GAPDH y COXIV como marcadores de proteínas citosólicas y mitocondriales, respectivamente. (C) Sensibilidad a la proteinasa K de mt-ELP3. Las mitocondrias purificadas de células que sobreexpresan mt-ELP3 se dejaron sin tratar (-), se trataron (+) con proteinasa K o se trataron con proteinasa K en presencia de concentraciones crecientes de digitonina o proteinasa K con Triton X-100 al 0,3%. Se utilizaron HSP60 y TOM20 como marcadores de mitoplasto mitocondrial y membrana externa, respectivamente.

ELP3 contiene un dominio de histona/lisina acetiltransferasa en su extremo carboxilo con una homología significativa con el dominio catalítico de la familia de acetiltransferasas GNAT (acetiltransferasa N-terminal relacionada con Gcn5). ELP3 acetila histonas10 y otras proteínas no histonas11,23. La acetilación de la proteína lisina es un importante mecanismo regulador de las enzimas metabólicas en las mitocondrias27,28,29.

Dado que mt-ELP3 tiene un dominio de acetiltransferasa, especulamos que puede afectar el estado de acetilación de las proteínas mitocondriales. Para probar esta hipótesis, evaluamos los niveles globales de acetilación mitocondrial en células de control y células que sobreexpresan mt-ELP3 utilizando dos métodos diferentes: Western blot y espectrometría de masas. El análisis de transferencia Western con un anticuerpo pan-acetilisina comercial no reveló cambios globales en los niveles de acetilación de proteínas mitocondriales en células que sobreexpresan mt-ELP3 en comparación con las células de control (Fig. 2). El análisis de espectrometría de masas tampoco mostró ningún cambio global en el nivel de acetilación mitocondrial en las células que sobreexpresan mt-ELP3, en comparación con las células de control (Tabla complementaria 2).

La sobreexpresión de mt-ELP3 no afecta la acetilación de proteínas mitocondriales. Análisis de transferencia Western del estado de acetilación de lisina (Ac-K) en fracción mitocondrial y citoplasmática aislada de células T-REx-293 tratadas (+Tet) o no (−Tet) con tetraciclina. Ponceau se utilizó como control de carga.

A continuación, probamos si mt-ELP3 está involucrado en modificaciones de mt-tRNA. ELP3 no solo cataliza la acetilación de residuos de lisina en péptidos y proteínas, sino que también actúa como una enzima modificadora de ARNt no canónica13,30. En eucariotas, se requiere ELP3 canónico para la síntesis de cadenas laterales de 5-metoxicarbonilmetilo (mcm5) y 5-carbamoilmetilo (ncm5) en uridinas en la posición oscilante (posición 34 en el ARNt) de un subconjunto de cyt-ARNt12. La base oscilante modificada con mcm5U34 se tiola aún más a 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina (mcm5S2U) en tRNALys UUU, tRNAGlu UUC y tRNAGln UUG31, y la presencia de una cadena lateral mcm5 o ncm5 es un requisito previo para una tiolación eficiente en estos cito- ARNt32. Los ARNmt correspondientes también se modifican en la posición oscilante de la uridina, que es 5-taurinometil-2-tiouridina (τm5S2U) 33.

Para evaluar un posible papel de mt-ELP3 en la modificación de los mt-tRNA, analizamos la sensibilidad a la digestión con la RNasa angiogenina específica de tRNA de mt-tRNAGlu, mt-tRNALys y mt-tRNALeu (con la modificación τm5U) y mt-tRNAVal. (sin la modificación τm5U) de células de control y de células que sobreexpresan mt-ELP3. Los ARNt que carecen de modificación en la posición de oscilación son más sensibles a la digestión mediada por angiogenina que los ARNt modificados correspondientes34,35,36. Después de la digestión con angiogenina in vitro del ARN total purificado de células de control y células que sobreexpresan mt-ELP3, los productos digeridos se analizaron mediante análisis de transferencia Northern con una sonda de oligodesoxinucleótido marcada con digoxigenina (DIG) específica para los mt-ARNt mencionados. Mt-tRNAGlu, mt-tRNALys y mt-tRNALeu (UUR) de las células de control fueron más sensibles a la escisión mediada por angiogenina que aquellas de células que sobreexpresan mt-ELP3 (Fig. 3A). Por el contrario, no encontramos diferencias en los patrones de digestión de mt-tRNAVal (que no lleva ninguna modificación de τm5U) (Fig. 3A). Estos resultados son consistentes con el modelo de que mt-ELP3 aumenta la síntesis o estabilidad de la modificación τm5U en estos mt-tRNA.

La sobreexpresión de mt-ELP3 protege el sustrato de mt-tRNA de la escisión mediada por angiogenina sin alterar los niveles de 2-tiolación. (A) y (B) Análisis Northern de mt-tRNALys, mt-tRNALeu, mt-tRNAGlu y mt-tRNAVal después de la digestión con angiogenina in vitro de ARN pequeños purificados de células de control y células que sobreexpresan mt-ELP3 (A), y de control células y células que sobreexpresan mt-ELP3 mut (B) durante los tiempos indicados. El histograma adjunto muestra el análisis cinético de las digestiones con angiogenina. Las cantidades de ARNmt intacto después de 0, 10, 20 y 30 minutos de incubación con angiogenina se representan como cambios en relación con el control no digerido (0 minutos). Todos los datos son media ± DE de al menos tres experimentos. *p < 0,05. (C) Análisis APM-norte de 2-tiolación de mt-tRNALys, mt-tRNALeu y mt-tRNAGlu de células de control y células que sobreexpresan mt-ELP3. Se procesaron las mismas cantidades de ARN total (5 µg) en un gel desnaturalizante de poliacrilamida-urea en presencia (+) o ausencia (-) de APM. Los ARNt tiolados se detectaron como bandas retardadas en presencia de APM. La membrana APM (-) se sondeó con ARNr 5S como control de carga. (D) mt-ELP3 interactúa con GTPBP3. Las células HEK 293T se cotransfectaron con plásmidos pcDNA mt-ELP3-Flag y pCMV6 GTPBP3 como se indica, y los lisados ​​​​se inmunoprecipitaron con anticuerpo anti-Flag. Las proteínas precipitadas se inmunotransfirieron con anticuerpos anti-ELP3, GTPBP3 y VDAC. Se utilizaron perlas mezcladas con lisado sin anticuerpo anti-Flag y perlas mezcladas con anticuerpo anti-Flag sin lisado como control negativo 1 y 2, respectivamente.

Para probar si el dominio KAT de mt-ELP3 es necesario para la modificación de mt-tRNA, generamos una construcción de mt-ELP3 mutada (mt-ELP3 mut) introduciendo una mutación (GFG → FAF) en su dominio KAT 37,38 (Figs. .S4, S5). No encontramos diferencias en la escisión de ARN mediada por angiogenina de células de control y células que sobreexpresan mt-ELP3 mut (Fig. 3B), lo que indica que el dominio KAT de mt-ELP3 es esencial para su función de mt-tRNA.

La modificación τm5U34 se tiola aún más a τm5S2U en mt-tRNALys, mt-tRNAGlu y mt-tRNAGln39,40. Preguntamos si mt-ELP3 también afecta la 2-tiouridilación en estos mt-tRNA. La tiolación de U34 puede detectarse mediante transferencia Northern en presencia de cloruro de [(N-acriloilamino)fenil]mercúrico (APM). En este análisis, el APM polimerizado en el gel interactúa específicamente con los ARNt que contienen un grupo tiol, retardando así su migración41,42. Los niveles de 2-tiouridilación de mt-tRNAGlu y mt-tRNALys en células que sobreexpresan mt-ELP3 fueron comparables con los de las células de control (Fig. 3C). Por el contrario, no se observó ningún retraso con mt-tRNALeu, que de forma nativa no está tiolado. Estas observaciones indican que mt-ELP3 no afecta la tiolación en la posición 2 de los mt-tRNA.

La sobreexpresión (Fig. S6A) o la regulación negativa (Fig. S6B) de ELP3 canónico conduce a un aumento y disminución del nivel de 2-tiol, respectivamente, en cyt-tRNA (Fig. S6C, D); sin embargo, la sobreexpresión de mt-ELP3 no aumentó el nivel de tiol en los mt-tRNA (Fig. 3C), lo que respalda la idea de que las modificaciones de τm5 y 2-tiol en los mt-tRNA parecen proceder de forma independiente, de manera similar a los informes publicados43,44. Se cree que las enzimas modificadoras de ARNt codificadas en el núcleo, MTO1 y GTPBP3, son responsables de la síntesis de la modificación τm5U34 en ARNmt que codifican Lys, Leu, Glu, Gln y Trp45. Según nuestras observaciones de que mt-ELP3 parece estar involucrado en la síntesis de τm5U, predijimos que mt-ELP3 interactúa con GTPBP3 y con MTO1. El análisis de espectrometría de masas de proteínas que co-inmunoprecipitan con mt-ELP3-FLAG condujo a la identificación de GTPB3 (datos no mostrados). Para confirmar esta interacción, coexpresamos GTPBP3 y mt-ELP3 etiquetado con Flag en células HEK293T y descubrimos que al tirar hacia abajo con un anticuerpo Flag-tag, se podía detectar GTPBP3 (Fig. 3D). Estos resultados confirman la interacción proteína-proteína entre mt-ELP3 y GTPBP3.

Una modificación de taurina en U34 (τm5S2U34) es crucial para regular la eficiencia de la traducción mitocondrial y la precisión de la interacción codón-anticodón46, y el defecto de GTPBP3 provoca una deficiencia en la traducción mitocondrial44,47. Por lo tanto, razonamos que la sobreexpresión de mt-ELP3 podría aumentar la traducción mitocondrial. Para examinar la actividad de traducción mitocondrial, utilizamos un experimento de química de clic de marcado de pulsos no radiactivo48. Específicamente, tratamos células de control y células que sobreexpresan mt-ELP3 con el derivado de alquino-metionina, L-homopropargilglicina (HPG), con o sin cicloheximida (inhibidor específico de la traducción citosólica) y/o cloranfenicol (un inhibidor específico de la traducción mitocondrial). El análogo de metionina HPG se incorporó a la proteína naciente en lugar de la metionina y posteriormente se visualizó mediante etiquetado de fluorescencia quimioselectiva mediante química de clic48,49.

Como se predijo, la traducción mitocondrial aumentó en las células que sobreexpresan mt-ELP3 en comparación con las células de control (Fig. 4A, centro derecha y B (HPG + CHX)). En particular, el aumento se eliminó mediante el tratamiento con cloranfenicol, lo que indica que la señal resistente a la cicloheximida representa exclusivamente proteínas mitocondriales recién sintetizadas (Fig. 4A, derecha y B (HPG +CHX +CHL)). Sin embargo, no se detectó ninguna señal sin HPG (Fig. 4A, izquierda). Además, la cantidad total de proteínas recién sintetizadas (citosólicas y mitocondriales) fue mayor en las células que sobreexpresan mt-ELP3 que en las células de control, como lo demuestra la señal de HPG sin cicloheximida y cloranfenicol (Fig. 4A, centro izquierda y B (HPG)). Como apoyo a las mediciones de la señal de HPG, también cuantificamos la señal de HPG en células de control y células que sobreexpresan mt-ELP3 con cicloheximida (traducción mitocondrial) mediante citometría de flujo. Encontramos significativamente más señal de HPG en las células que sobreexpresan mt-ELP3 que en las células de control, lo que coincide con los datos de la microscopía de fluorescencia (Fig. 4C, D). Estas observaciones indican que la sobreexpresión de mt-ELP3 aumenta la tasa de traducción mitocondrial.

La sobreexpresión de mt-ELP3 da como resultado un aumento en la traducción mitocondrial. (A), (B), (C) y (D) Evaluación de la traducción mitocondrial. La síntesis de proteínas mitocondriales de novo se visualizó en células HEK293T transfectadas transitoriamente con plásmido vacío (pcDNA T0) o plásmido mt-ELP3 (pcDNA mt-ELP3) mediante incubación con o sin HPG (1 h) y con o sin cicloheximida (CHX) y/ o cloranfenicol (CHL). Después de 1 h, las células se fijaron, se sometieron a la reacción de clic y se analizaron para determinar la incorporación de HPG marcada con fluorescencia mediante microscopía de fluorescencia (A) o citometría de flujo (C). La señal de HPG se calculó y se presentó gráficamente (B, D). Todos los datos son media ± DE de al menos tres experimentos. *p < 0,05. ns: no significativo.

La traducción mitocondrial es responsable de la síntesis de 13 subunidades de OXPHOS codificadas mitocondrialmente. Para evaluar un papel potencial en OXPHOS, medimos los niveles en estado estacionario de los complejos OXPHOS mediante electroforesis en gel Blue-Native (Fig. 5A). Curiosamente, los niveles de complejo I (CI), complejo III (C III), complejo IV (C IV) y complejo V (CV) fueron mayores en las células que sobreexpresaban mt-ELP3 que en las células de control (Fig. 5B). Es importante destacar que la sobreexpresión de mt-ELP3 mut no afectó la expresión de estos complejos (Fig. 5C, D). En particular, el aumento de la expresión de complejos OXPHOS en células que sobreexpresan mt-ELP3 estuvo acompañado por un aumento en los niveles en estado estacionario de las subunidades OXPHOS codificadas mitocondriales (Fig. 5E). No se observaron cambios en los niveles de subunidades OXPHOS codificadas en mitocondrias cuando se sobreexpresa mt-ELP3 mut (Fig. 5E).

La sobreexpresión de mt-ELP3 da como resultado un aumento en la expresión de complejos mitocondriales OXPHOS y la respiración mitocondrial. (A) y (C) Gel BN-PAGE representativo teñido con Coomassie Brilliant Blue de complejos respiratorios purificados de células de control (pcDNA T0) y células que sobreexpresan mt-ELP3 (pcDNA mt-ELP3) (A), y de células de control (pcDNA T0) y células que sobreexpresan el mutante mt-ELP3 (pcDNA mt-ELP3 mut) (C). Se cargó una alícuota de 20 µg de cada muestra por pocillo. Se cargó una alícuota de 5 µl de estándar de proteína sin teñir NativeMark (marcador). (B) y (D) PÁGINA nativa azul representativa de complejos OXPHOS en células HEK293T transfectadas con pcDNA4 T0 o pcDNA mt-ELP3 (B) y con pcDNA4 T0 o pcDNA mt-ELP3 mut (D). Los diagramas de dispersión muestran las mediciones densitométricas de los complejos OXPHOS normalizados al complejo II (control de carga) y representados como cambios en relación con las células de control. (E) Inmunotransferencias representativas de las subunidades mitocondriales OXPHOS ND1 (complejo I), MTCO1 (complejo IV), CytB (complejo III), ATP5A (complejo V) y SDHA (complejo II) en células HEK293T transfectadas con pcDNA4 T0, pcDNA mt-ELP3 o pcDNA-mt-ELP3 mut. Las membranas también se sondaron con un anticuerpo contra ELP3 y b-actina; se utilizó B-actina como control de carga. (F) y (G) Tasa de consumo de oxígeno (OCR). Se sometieron números iguales de células HEK293T transfectadas transitoriamente con pcDNA T0 o pcDNA mt-ELP3 a mediciones del consumo de oxígeno en un analizador de flujo extracelular Seahorse XF96, con adiciones secuenciales de inhibidores/activadores metabólicos: oligomicina, FCCP, antimicina A (Ant A) y rotenona (F) El diagrama de dispersión muestra OCR basal (determinado como la diferencia entre OCR antes y después de oligomicina y OCR después de rotenona/antimicina A/rotenona), OCR ligado a ATP (diferencia entre OCR antes y después de oligomicina), OCR máximo, capacidad de reserva ( diferencia entre la tasa estimulada por FCCP y el OCR basal) y la fuga de protones (diferencia entre el OCR basal y el OCR ligado a ATP) en células pcDNA T0 y pcDNA mt-ELP3 (G). Todos los datos son media ± DE de al menos tres experimentos diferentes. *p < 0,05, **p < 0,01. ns: no significativo.

A continuación, probamos el efecto de la sobreexpresión de mt-ELP3 en la respiración mitocondrial utilizando un analizador de flujo extracelular Seahorse XF96 con una serie de inhibidores metabólicos y agentes desacopladores (Fig. 5F). Observamos que la tasa de consumo de oxígeno basal (OCR), la capacidad respiratoria mitocondrial ligada al ATP y de reserva (ATP que se puede utilizar durante los aumentos en la demanda de energía) fueron significativamente mayores en las células que sobreexpresan mt-ELP3 que en las células de control y no se encontraron diferencias. en los niveles de fuga de ATP entre estas células (Fig. 5G). En general, estos hallazgos indican que la sobreexpresión de mt-ELP3 aumenta la respiración mitocondrial.

En el presente estudio, intentamos identificar candidatos a acetiltransferasa mitocondrial mediante un enfoque bioinformático. Esto condujo a la identificación de una nueva variante de empalme y una isoforma de ELP3 localizada en la matriz mitocondrial. Sorprendentemente, este ELP3 mitocondrial (mt-ELP3) no participa en la acetilación de proteínas mitocondriales, sino más bien en la modificación postranscripcional de mt-tRNA, mediante la cual regula la traducción y la respiración del ARN mitocondrial.

Nuestros resultados demostraron claramente la localización de una forma corta de ELP3 en el mitoplasto mitocondrial. Si bien informes anteriores han indicado que ELP3 se localiza en las mitocondrias26,38, un homólogo de ELP3 en Toxoplasma gondii es una proteína anclada en la cola ubicada en la membrana mitocondrial externa del parásito debido a su exclusivo dominio transmembrana C-terminal (TMD)38. Sin embargo, ELP3 de mamífero carece de un dominio TMD, lo que indica que otro mecanismo, muy probablemente la presencia de secuencias objetivo mitocondriales terminales NH2, está involucrado en su importación mitocondrial.

La localización de ELP3 en las mitocondrias sugirió una función nueva y desconocida en este orgánulo. Inesperadamente, la sobreexpresión de mt-ELP3 no aumentó los niveles de acetilación de lisina mitocondrial. Estudios recientes han demostrado que ELP3 actúa como una acetiltransferasa no canónica que cataliza reacciones en ARNt en lugar de proteínas13,30,50. Por lo tanto, ELP3 ahora se considera una enzima modificadora de ARNt que cataliza el paso inicial en la formación de mcm5U, mcm5s2U y ncm5U en uridinas en la posición de base oscilante de un subconjunto de ARNt citosólicos13.

Razonamos que mt-ELP3 podría estar involucrado en la modificación postranscripcional de los mt-tRNA. Al igual que los ARNt citoplasmáticos, un subconjunto de ARNt mitocondriales también se modifica en la posición U34. Una modificación de τm5S2U es la contraparte mitocondrial de mcm5s2U (Suzuki y Suzuki, 2014). De acuerdo con la hipótesis de que mt-ELP3 podría modificar los ARNt mitocondriales, encontramos que la sobreexpresión de mt-ELP3 disminuye la sensibilidad de mt-tRNALeu, mt-tRNALys y mt-tRNAGlu a la digestión de angiogenina, lo que indica un papel regulador de mt-ELP3 en la modificación τm5S2U34. Cabe destacar que un defecto en MTO1 y/o GTPBP3, dos proteínas que se predice que catalizarán conjuntamente la adición de la modificación τm5S2U34, aumenta la sensibilidad de sus sustratos de mt-tRNA (mt-tRNA que decodifican Lys, Glu, Gln, Leu(UUR ), y Trp) a la digestión con angiogenina35,36,47. Además, nuestros resultados mostraron que mt-ELP3 interactúa físicamente con GTPBP3. Por lo tanto, concluimos que mt-ELP3 tiene un papel en la biogénesis de la modificación τm5S2U de estos mt-tRNA.

Nuestros datos también indican que mt-ELP3 no controla la modificación del tiol en la posición 2, ya que la sobreexpresión de mt-ELP3 no afectó el estado de tiolación de estos mt-tRNA. Estos datos indican además que la tiolación en la posición 2 (S2U34) es independiente de la modificación en la posición 5 (τm5U34)35,44. Como se señaló anteriormente, MTO1 y GTPBP3 catalizan cooperativamente la modificación de τm5U34, ya que un defecto en estas proteínas da como resultado directamente una modificación deficiente de τm5U34 de sus sustratos de ARNmt. Sin embargo, Asano et al. (2018) demostraron que la formación de τm5U34 tenía una eficiencia de solo el 3,3% al intentar reconstituir τm5U34 in vitro con el complejo GTPBP3-MTO1, taurina, 5,10-CH2-THF, GTP y cofactores45, lo que sugiere que una La proteína es necesaria para la formación eficiente de τm5U34. Sugerimos que mt-ELP3 desempeña un papel en la biogénesis de τm5U34, y se justifican más estudios que evalúen la formación de τm5U34 en presencia de mt-ELP3.

Alternativamente, mt-ELP3 podría catalizar un homólogo no caracterizado de la modificación τm5S2U34 en mt-tRNA. Curiosamente, se detectó 5-carboximetilaminometiluridina (cmnm5U) en mt-tRNA en células HeLa cultivadas en condiciones empobrecidas en taurina45. cmnm5U es estructuralmente similar a τm5S2U34 y ocurre en la posición oscilante de un subconjunto de ARNt bacterianos y en levaduras y nematodos51. Las proteínas bacterianas MnmE y MnmG (homólogos de GTPBP3-MTO1) utilizan conjuntamente glicina (en lugar de taurina) como sustrato para sintetizar la modificación de cmnm5U. Sin embargo, los homólogos de ELP3 están presentes en algunas bacterias y virus, y su presencia coincide con la falta de genes que codifiquen MnmE y MnmG en estos organismos51,52,53. Dado que τm5S2U34 se sintetiza esencialmente cuando la concentración de taurina es alta, ELP3 probablemente se localiza en las mitocondrias y cataliza la modificación de cmnm5U en los ARNmt en su posición U34 en condiciones de estrés (p. ej., bajas concentraciones de taurina).

Curiosamente, en la levadura, la modificación de los ARNt dependientes de ELP3 es necesaria para la función mitocondrial en condiciones de estrés, y los defectos en esta modificación alteraron la síntesis de proteínas mitocondriales, lo que resultó en complejos OXPHOS defectuosos54. Si bien se necesitan estudios bioquímicos adicionales para comprender completamente el papel mecanístico de mt-ELP3 en la formación de τm5U34 o su homólogo, nuestros datos mostraron que el dominio KAT de mt-ELP3 es esencial para su función de mt-tRNA, como lo demuestra la pérdida de mt- Protección de los ARNt frente a la angiogenina al introducir una mutación en su dominio KAT.

La modificación τm5S2U34 tiene un papel fundamental en la eficiencia y precisión de la traducción mitocondrial. De hecho, la pérdida de la modificación τm5U34 causada por MTO1 y/o un defecto de GTPBP3 resultó en un defecto de traducción mitocondrial y contribuyó significativamente a la disfunción mitocondrial45,55,56. En el presente estudio, se observó un aumento en la tasa de traducción mitocondrial en células que sobreexpresan mt-ELP3, lo que coincide con nuestra función predicha de mt-ELP3 para catalizar la formación de τm5U34. Además, el aumento de la tasa de traducción mitocondrial se asoció con un aumento sustancial en los niveles en estado estacionario de los complejos OXPHOS, lo que resultó en un aumento en la producción de ATP mitocondrial.

La alteración de la actividad de modificación del ARNt de ELP3 canónico se asocia con varias enfermedades humanas, incluidos varios cánceres y trastornos neurodegenerativos18. Para comprender completamente el papel de mt-ELP3 en las manifestaciones clínicas de estas enfermedades, son necesarios estudios de la expresión tisular específica de mt-ELP3 en tejidos humanos. Nuestros datos preliminares indican que mt-ELP3 se expresa en el cerebro tanto a nivel de ARNm como de proteína (Fig. S7), pero también se expresa en varios de los otros tejidos, aunque en niveles más bajos. De acuerdo con estos datos, se detectó ELP3 en la fracción mitocondrial del cerebro de ratón25, lo que sugiere que es importante en este tejido.

En resumen, presentamos evidencia de que ELP3 se localiza en las mitocondrias y funciona como una enzima modificadora de mt-tRNA no canónica. Este estudio proporciona un marco para futuras investigaciones que aclararán los conocimientos mecanicistas sobre mt-ELP3 en la reacción de modificación del mt-tRNA y las contribuciones de su defecto en las enfermedades neurodegenerativas.

Las células humanas HEK-293T y HeLa se obtuvieron de ATCC y se cultivaron en medio completo: DMEM y EMEM, respectivamente, suplementados con 10% de suero bovino fetal (FBS) (Gibco) y 1% de penicilina/estreptomicina (Gibco) a 37 ºC y 5 %CO2.

Se adquirieron muestras de ARN de tejidos humanos de Taraka (clontech).

Para la generación de pcDNA ELP3 y pcDNA mt-ELP3, los ORF correspondientes se amplificaron mediante PCR y se clonaron en un vector pCDNA4.T0 con una etiqueta Flag en el extremo N.

El mutante del dominio KAT de ELP3 (pcDNA mt-ELP3 mut) se generó mediante mutagénesis basada en PCR utilizando cebadores específicos que albergan la mutación deseada y se utilizó pcDNA mt-ELP3 como plantilla. La mutación se confirmó mediante secuenciación (Figura S4). Los cebadores utilizados para la generación de este mutante fueron los siguientes:

KAT-F, 5′-CAAACTGATGCTGAAATTTAGTAGG -3′;

KAT-R, 5′-CTTTCATGCTGCTGATGGAGGAAGC-3′.

Para el plásmido GTPBP3, el clon ORF etiquetado humano GTPBP3 (NM_001128855) se adquirió de Origene (n.º de catálogo RC225798).

Para el ensayo de transfección, las células se transfectaron transitoriamente con un dúplex de ARNip de control (OriGene n.º SR30002) y dos ARNip Stealth dirigidos a ELP3 (ARNip ELP3 1 (OriGene n.º SR310519A) y ARNip 2 de ELP3 (OriGene n.º SR310519B)) o con plásmido derivado pcDNA 4/T0. expresando ELP3 canónico (pcDNA 4/T0-ELP3), mt-ELP3 (pcDNA 4/T0-mt-ELP3), mt-ELP3 mutante (pcDNA 4/T0-mt-ELP3) o pcDNA 4/T0 vacío (pcDNA 4/ T0) con reactivo Lipofectamine 3000, según instrucciones del fabricante. Las células se procesaron después de 2 días de transfección.

Se generaron líneas celulares HEK293 inducibles que expresan mt-ELP3 utilizando el kit Flp-In T-REx Core de Invitrogen. Brevemente, el ADNc que codifica mt-ELP3 se subclonó en el vector de expresión inducible, pcDNA5/FRT/TO utilizando pcDNA mt-ELP3 como plantilla. Luego se cotransfectaron células Flp-In T-REx-293 con el vector de expresión inducible pcDNA5/FRT/TO que contiene el ADNc de mt-ELP3 y el vector pOG44 que codifica la recombinasa Flp utilizando OptiMEM/Lipofectamine2000 según las instrucciones del fabricante. Después de 48 h de transfección, las células se lavaron con PBS y se incubaron con medio selectivo que contenía 200 mg/ml de higromicina. El medio selectivo se cambió a intervalos regulares hasta que se cultivó el número deseado de células. Posteriormente, las células resistentes a la higromicina se mantuvieron en DMEM que contenía FBS al 10 %, 5 µg/ml de blasticidina y 250 µg/ml de zeocina.

La expresión de mt-ELP3 se indujo mediante la adición de tetraciclina (1 ug/ml) al medio de cultivo durante 24 h.

El aislamiento de ARN total se realizó utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen), según las recomendaciones del fabricante. Se convirtió un microgramo de ARN en ADN complementario utilizando un kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad (Applied Biosystems) y luego se diluyó con 180 µl de H2O. La expresión génica se midió utilizando un sistema en tiempo real CFX384 (Bio-Rad) y Thermo Scientific Maxima 2 × SYBR Green. El producto de PCR amplificado se procesó en electroforesis en gel de agarosa y se comparó con la escalera de ADN y luego se visualizó con un transiluminador UV. Los cebadores ELP3 utilizados se proporcionan en la Tabla S1.

La transferencia Northern de geles que contienen APM se realizó como se describe para evaluar el estado de tiolación de los ARNt57. Brevemente, se pasó ARN total (5 µg) en un gel de poliacrilamida al 15% que contenía urea 7 M y 10 µg/ml de APM y luego se transfirió a membranas de nailon cargadas positivamente (Roche). Los pasos de prehibridación e hibridación se realizaron con Dig Easy Hyb (Roche), según las instrucciones del fabricante. La presencia de especies de ARNt se detectó con sondas de oligodesoxinucleótidos sintéticas marcadas con DIG específicas (Tabla S1).

Los ensayos de sensibilidad a la angiogenina nucleasa se realizaron esencialmente como se describe58. En resumen, se mezclaron 1 µg de ARN total con 2,5 µg/ml de angiogenina recombinante (ANG) en tampón (HEPES 30 mM, pH 7,4, NaCl 30 mM, BSA al 0,01%). Las mezclas se incubaron a 37 °C durante los tiempos indicados. La angiogenina se inactivó añadiendo 5 µl de Gel Loading Buffer II (Life Technologies). Las muestras de ARN digeridas se separaron en geles de poliacrilamida al 15% y urea 8 M y se transfirieron a membranas de nailon cargadas positivamente. El ARN se entrecruzó con la membrana (60 °C, 1 h) utilizando una solución de entrecruzamiento de EDC recién preparada59,60. La prehibridación y la hibridación se realizaron con Dig Easy Hyb (Roche), según las instrucciones del fabricante. Las especies de ARNt se detectaron con sondas de oligodesoxinucleótidos sintéticas marcadas con DIG específicas (Tabla S1).

BN-PAGE se llevó a cabo como se detalla61. Las muestras que contenían 15 µg de proteína se separaron en gel Bis-Tris Novex NativePAGE al 3–12% (Life Technologies). Los niveles relativos de los complejos respiratorios ensamblados IV se evaluaron mediante transferencia Western con los siguientes anticuerpos: anti-ND1 (Thermo Fisher, 19703-1-AP), anti-SDHA (Cell signaling, 5839), anti-MTCO1 (Thermo Fisher, 459600 ), anti-ATP5a (Abcam, 11448) y anti-Cytb (Abclonal, A17966). Se utilizaron anticuerpos anti-IgG de conejo (Sigma, A6154) y anti-IgG de ratón (Sigma, A4416) conjugados con peroxidasa de rábano picante como anticuerpos secundarios y las señales de proteínas se detectaron utilizando el sistema ECL. Los geles Bis-Tris Novex NativePAGE (3–12%) se tiñeron con una solución de tinción de proteína Coomassie (50% de metanol, 7% de ácido acético y 0,1% de tinción Coomassie Brilliant Blue R).

Las células HEK293T se recogieron mediante centrifugación a 500 xg durante 5 minutos. Las células se lisaron en tampón RIPA y los homogeneizados se aclararon mediante centrifugación y se analizaron para determinar la concentración de proteínas utilizando el kit BCA (Thermo Scientific). Los lisados ​​de proteínas se separaron en geles con gradiente de 4 a 20% y se transfirieron a membranas de PVDF.

El fraccionamiento subcelular se llevó a cabo como se describe con una ligera modificación62. Las células se homogeneizaron suavemente en tampón hipotónico (Hepes 10 mM, pH 7,9, KCl 10 mM, EDTA 0,1 mM) que contenía inhibidores de proteasa (PMSF 0,5 mM e inhibidor de proteasa completo (Roche)) durante 30 minutos en hielo con el uso de un homogeneizador Dounce. hasta que la gran mayoría de las células se rompieron y los núcleos se tiñeron con azul tripán, y luego se centrifugaron a 800xg durante 5 min a 4 °C para obtener un sedimento (fracción nuclear). El sobrenadante se centrifugó a 15.000 × g durante 10 min a 4 ° C para obtener una fracción mitocondrial (pellet) y una fracción citosólica (sobrenadante). El sedimento mitocondrial se lavó y se suspendió en tampón hipotónico. La concentración de proteínas y la inmunotransferencia se realizaron como se describe anteriormente. Cuando se indicó, la fracción mitocondrial se incubó con proteinasa K (0,5–2 mg/ml) en tampón hipotónico en presencia de concentraciones crecientes de digitonina o proteinasa K con Triton X-100 al 0,3% durante 15 minutos a 37 °C. Después de 15 minutos, se finalizó la digestión añadiendo 5 µl de PMSF 200 mM. Las muestras se hirvieron durante 5 minutos y se analizaron mediante transferencia Western.

Para la inmunodetección se utilizaron los siguientes anticuerpos: anti-ELP3 (señalización celular, 5728S), anti-COX IV (señalización celular, 4850T), anti-GAPDH (Abcam, AB9484), anti-HSP60 (señalización celular, 4870S), anti -TOM20 (señalización celular, 42406), anti-Flag (Sigma, F1804-200UG), anti-lisina-acetilada (señalización celular, 9441), anti-GTPBP3 (Invitrogen, PA5-31323) y anti-VDAC (señalización celular, 4661).

Las células HeLa se cultivaron sobre cubreobjetos en placas de 24 pocillos durante la noche. Después de las transfecciones transitorias, las células se lavaron con PBS, se fijaron con paraformaldehído al 4%-PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente, se lavaron con PBS, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,3% en PBS durante 15 minutos y se lavaron nuevamente con PBS. Después de bloquearse con una solución que contenía BSA al 2 %, Tritón X-100 al 0,05 % en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT), las células se incubaron con anticuerpos anti-COX IV y anti-Flag en una solución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. . Tras el lavado con solución de bloqueo, los anticuerpos unidos se detectaron posteriormente mediante incubación, según corresponda, anticuerpos secundarios anti-conejo conjugados con AlexaFluor 594 (11,012, Invitrogen) y anti-ratón conjugados con AlexaFluor 488 (A11001, Invitrogen) en solución de bloqueo durante 1 h. en RT. Después de teñir con 1 mg/ml de DAPI en PBS, las células se examinaron utilizando un microscopio confocal Leica.

Se cotransfectaron células 293HEKT con los plásmidos indicados. Después de 72 h después de la transfección, las células transfectadas se recogieron y se lisaron con tampón de lisis IP (termo científico). Los sobrenadantes se obtuvieron por centrifugación a 16.000 × g durante 10 min a 4 °C. La coinmunoprecipitación se realizó utilizando el kit de inmunoprecipitación Dynabeads Protein G (Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se incubaron 10 µg de anticuerpo anti-Flag M2 con proteína G Dynabeads durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después del lavado, el complejo anticuerpo-Dynabeads se incubó (1 h) con 300 µg de lisados ​​de proteínas (sobrenadante). Después de los lavados, los complejos inmunes se eluyeron en 20 µl de tampón de elución y se analizaron mediante inmunotransferencia. Las Dynabeads también se incubaron con anticuerpo anti-Flag M2 (sin lisados) y con lisados ​​(sin anticuerpo anti-Flag M2) y se usaron como control negativo.

La síntesis de novo de proteínas mitocondriales se realizó como se describe48. Se sembraron células HEK239T en portaobjetos de cámara lab-tek (ThermoFisher Scientific) y se transfectaron con pcDNA-T0 o pcDNA-mt-ELP3 etiquetado con Flag. Después de la transfección, las células se incubaron en DMEM sin metionina durante 30 minutos. Luego, el medio se reemplazó por DMEM sin metionina que contenía el análogo de metionina L-homopropargilglicina (HPG), y la traducción citosólica y mitocondrial se inhibió con 50 µg/ml de cicloheximida (CHX) y 100 µg/ml de cloranfenicol (CHL), respectivamente. Después del período de etiquetado, los portaobjetos se colocaron inmediatamente en hielo y las células se permeabilizaron previamente con digitonina al 0,005 % en tampón A (HEPES/KOH 10 mM, NaCl 10 mM, MgCl2 5 mM y sacarosa 300 mM en H20, pH 7,5) durante 2 min a temperatura ambiente antes de fijarlo en formaldehído al 8% precalentado en tampón A durante 15 min. Luego, las células se permeabilizaron completamente con Triton X-100 al 0,5% en PBS. Las proteínas mitocondriales marcadas con pulsos se detectaron con una cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre (sulfato de cobre 600 mM, BTTAA 1,2 mM, azida picolilo Alexa Fluor 594 (CLK-1296-1) 40 µM y ascorbato de sodio 2 mM en PBS) mediante un haga clic en reacción química durante 1 h a temperatura ambiente.

Se tomaron imágenes de las muestras utilizando un microscopio confocal LSM700. Después de obtener imágenes, cada célula teñida con HPG se seleccionó dibujando un contorno cerca del borde visible. Luego se calculó la intensidad media de los píxeles para cada región delimitada que representa la celda. La selección y el análisis se realizaron con software personalizado escrito en Python.

Para la intensidad de fluorescencia medida por citometría de flujo, también se añadió el anticuerpo anti-DYKDDDDK (Flag-Tag) Brilliant Violet 421™ (n.º de catálogo 637322, BioLegend) en una dilución de 1:50 a la reacción de clic para clasificar las células transfectadas que expresan mt-ELP3. Luego, las células se lavaron con 1XPBS y se resuspendieron en 100 µl de 1xPBS para adquirirlas en un citómetro de flujo. Las células se adquirieron en FACS Aria II (BD Biosciences) con la señal HPG recolectada en el filtro Cherry mientras que Flag se recogió en el filtro BV421. Los archivos fcs posteriores a la adquisición se analizaron utilizando el software Flow jo v10 (BD Biosciences). Las células se representaron como distribución bimodal de Cherry (HPG) frente a BV421 (Bandera), la MFI (intensidad de fluorescencia media) de HPG se cuantificó en la población Flag + y Flag-.

La tasa de consumo de oxígeno (OCR) se evaluó mediante un analizador Seahorse XF96.

Las células se sembraron en microplacas Seahorse XF96 a 4 x 104 células/pocillo y se incubaron a 37 °C en una incubadora sin CO2 durante 1 h en medio preparado (CaCL2 1,8 mM, NaCl 139 mM, HEPES 20 mM, NaHCO3 1 mM, 25 Glucosa mM, piruvato 1 mM y glutamina 4 mM, pH 7,4) antes del análisis. El perfil bioenergético se realizó monitoreando el consumo de oxígeno en niveles basales, seguido de la inyección secuencial de los siguientes inhibidores: oligomicina 2 µM, cianuro de carbonilo-4-(trifluorometoxi)-fenilhidrazona 0,5 µM, antimicina 4 µM y mixotiazol 4 µM. Todas las mediciones se normalizaron frente al número total de células en cada pocillo mediante imágenes de núcleos teñidos.

Se investigaron tres experimentos biológicos independientes (con réplicas técnicas adicionales) de células de control de células HEK 293T (-Tetra) y células que sobreexpresan ELP3 mitocondrial (+Tetra) mediante enriquecimiento en acetilo seguido de análisis espectrométrico de masas. Los lisados ​​​​celulares se sumergieron en tampón de lisis que contenía urea 8 M, bicarbonato de trietilamonio (TEAB) 200 mM, pH 8,5, cloruro de sodio 75 mM, tricostatina A 1 µM, nicotinamida 3 mM y 1 x cóctel inhibidor de proteasa/fosfatasa (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y se homogeneizaron durante 2 ciclos con un Bead Beater TissueLyser II (Qiagen, Germantown, MD) a 24 Hz durante 3 minutos cada uno. Los lisados ​​​​se clarificaron mediante centrifugación a 15.700 x g durante 15 minutos a 4 ° C y se recogió el sobrenadante que contenía las proteínas solubles. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando un ensayo de proteína de ácido bicinconínico (BCA) (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) y, posteriormente, se llevaron 1 a 2 mg de proteína de cada muestra a un volumen igual utilizando una solución de urea 8 M en 50 mM. TEAB, pH 8. Las proteínas se redujeron usando ditiotreitol (DTT) 20 mM en TEAB 50 mM durante 30 min a 37 °C, y después de enfriar a temperatura ambiente, se alquilaron con yodoacetamida (IAA) 40 mM en TEAB 50 mM durante 30 min. temperatura ambiente en la oscuridad. Las muestras se diluyeron cuatro veces con TEAB 50 mM, pH 7,5, y las proteínas se digirieron durante la noche con una solución de tripsina de grado de secuenciación (Promega, San Luis Obispo, CA) en TEAB 50 mM a una enzima 1:50 (peso: peso): proporción de proteínas a 37 °C. Esta reacción se detuvo con ácido fórmico (FA) al 1% y la muestra se aclaró mediante centrifugación a 2000 xg durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las muestras de péptidos clarificados se desalinizaron con cartuchos absorbentes Oasis de 10 mg (Waters, Milford, MA) y, posteriormente, todas las muestras desaladas se secaron al vacío. Las digestiones se resuspendieron en 1,4 ml de tampón de purificación por inmunoafinidad (IAP) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) que contenía ácido 4-morfolinopropanosulfónico (MOPS) 50 mM/hidróxido de sodio, pH 7,2, fosfato disódico 10 mM y fosfato disódico 50 mM. Cloruro de sodio para enriquecimiento con PTM. Los péptidos se enriquecieron para la acetilación con anticuerpo anti-acetilo conjugado con perlas de agarosa (kit Acetil-Lisina Motif; Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Este proceso se realizó según el protocolo del fabricante y cada muestra se incubó durante la noche con medio vial de perlas lavadas. Finalmente, los péptidos enriquecidos en acetilo se eluyeron de los conjugados de anticuerpo-perla con ácido trifluoroacético al 0,1% en agua y se desalinizaron utilizando puntas zip C-18 (Millipore, Billerica, MA). Las muestras se secaron al vacío y se resuspendieron en FA al 0,2% en agua.

Las muestras se analizaron mediante HPLC-ESI-MS/MS de fase inversa utilizando un sistema HPLC 2D nano-LC Eksigent Ultra Plus (Dublín, CA) con un sistema cHiPLC (Eksigent) que estaba conectado directamente a un tiempo de vuelo cuadrupolo ( QqTOF) Espectrómetro de masas TripleTOF 6600 (o TripleTOF 5600) (SCIEX, Concord, CAN). Después de la inyección, las mezclas de péptidos se cargaron en un chip de precolumna C18 (chip ChromXP C18-CL de 200 µm × 0,4 mm, 3 µm, 120 Å, SCIEX) y se lavaron a 1–2 µl/min durante 10 minutos con el disolvente de carga. (H2O/0,1% ácido fórmico) para desalación. Posteriormente, los péptidos se transfirieron al chip ChromXP C18-CL de 75 µm × 15 cm, 3 µm, 120 Å (SCIEX) y se eluyeron a un caudal de 300 nL/min con gradientes de 2 a 3 h utilizando agua (A ) y tampones disolventes de acetonitrilo (B).

Identificar péptidos acetilados y construir bibliotecas espectrales. Cada ciclo consistió en un escaneo de iones precursores de 250 ms seguido del aislamiento de los 30 iones precursores más abundantes entre 400 y 1500 m/z (tiempo de acumulación de espectros de masas en tándem de 100 ms, lo que produce un tiempo de ciclo total de 3,25 s; producto de "alta sensibilidad"). modo de escaneo de iones, software: Analyst 1.7; compilación 96) como se describió anteriormente63.

Cuantificar los péptidos enriquecidos con PTM utilizando el espectrómetro de masas TripleTOF 6600. Cada ciclo consistió en una exploración de iones precursores de 250 ms con un rango de masa de 400 a 1250 m/z. Posteriormente, se pasan ventanas de ancho variable en pasos incrementales en todo el rango de masas (m/z 400–1250). El tiempo de ciclo de 3,2 s incluye el escaneo de iones precursores de 250 ms seguido de un tiempo de acumulación de 45 ms para cada uno de los 64 segmentos DIA variables (esquema de aislamiento de ventanas variables64) que monitorean masas de iones de fragmentos entre 100 y 1500 m/z.

Las adquisiciones dependientes de datos espectrométricos de masas (DDA) se analizaron utilizando el motor de búsqueda de bases de datos ProteinPilot (SCIEX Beta 4.5, revisión 1656) utilizando el algoritmo Paragon (4.5.0.0, 1654). Utilizando estos resultados del motor de búsqueda de bases de datos, se generaron bibliotecas espectrales MS/MS. La cuantificación se realizó en Skyline usando filtrado MS1 y cuantificación de datos DIA/SWATH MS2 (usando XIC de 6 a 10 iones de fragmentos de MS/MS, generalmente iones y y b, que coinciden con péptidos específicos presentes en las bibliotecas espectrales) como se describió anteriormente65. 66,67.

Los análisis estadísticos se realizaron utilizando Graph Pad Prism 9. Se utilizó la prueba t de Student en todas las comparaciones de datos. Las diferencias estadísticamente significativas entre las medias se indicaron con asteriscos (*p < 0,05, **p < 0,01 o ***p < 0,001) y las diferencias no significativas con ns.

Los datos sin procesar de espectrometría de masas se depositan en ftp://massive.ucsd.edu con el ID de MassIVE MSV000088668 (contraseña de invierno): Vaya a http://massive.ucsd.edu/ProteoSAFe/status.jsp?task=3b6b233db1d44e65aee8956d17eb7289. Ingrese el nombre de usuario y la contraseña en la esquina superior derecha de la página: Nombre de usuario: MSV000088668_reviewer; Contraseña: invierno Los datos sin procesar también están disponibles en ProteomeX change con el ID PXD030850 (será público una vez publicado).

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Este proyecto fue apoyado por el Instituto Buck para la Investigación sobre el Envejecimiento. Agradecemos el apoyo de la instrumentación para el sistema TripleTOF 6600 de la subvención de instrumentación compartida 1S10 OD016281 del NCRR (Instituto Buck). Agradecemos a Gary Howard por editar el manuscrito y a John CW Carroll por su ayuda con las figuras y los gráficos.

Instituto Buck para la Investigación sobre el Envejecimiento, 8001 Redwood Boulevard, Novato, CA, 94945, EE. UU.

Rachid Boutoual, Indra Heckenbach, Ritesh Tiwari, Herbert Kasler, Chad A. Lerner, Samah Shah y Eric Verdin

Institutos Gladstone y Universidad de California, San Francisco, San Francisco, CA, 94158, EE. UU.

Hyunsun Jo, Vincenzo Calvanese y Eric Verdin

Centro para el Envejecimiento Saludable, Departamento de Medicina Celular y Molecular, Universidad de Copenhague, Copenhague, Dinamarca

Indra Heckenbach y Morten Scheibye-Knudsen

Amgen Research, Amgen Inc., Sur de San Francisco, CA, 94080, EE. UU.

Mateo J. Rardin

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Conceptualización, RB y EV; Metodología, RB y EV; Investigación, RB (todos los experimentos), HJ (análisis bioinformático), IH y MSK (imágenes y análisis de IF), RT y HK (análisis de citometría de flujo), CAL (análisis de caballitos de mar), SS, BS y MJR (análisis proteómicos), HJ y VC (construcción y purificación de proteínas recombinantes). Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Rachid Boutoual o Eric Verdin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Boutoual, R., Jo, H., Heckenbach, I. et al. Una nueva variante de empalme de Elp3/Kat9 regula la modificación y función del ARNt mitocondrial. Representante científico 12, 14804 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-18114-x

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Recibido: 08 de abril de 2022

Aceptado: 05 de agosto de 2022

Publicado: 31 de agosto de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-18114-x

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